Учебно-методическое пособие Дисциплина- «Микробиология»
Скачать 2.13 Mb.
|
| ЧАСТЬ 2 ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.
Микроскоп – это оптический прибор для получения увеличенных изображений очень малых предметов. Современными моделями биологического микроскопа являются микроскопы серии «Биолам». Микроскоп состоит из оптической системы и механической части. Оптическая система предназначена для увеличения изображения предмета. Она включает увеличительную ( объектив и окуляр) и осветительную ( зеркало и конденсор с ирисовой диафрагмой и откидной линзой) системы. Объектив представляет собой систему линз, заключенных в трубку. В микроскопах «Биолам» используются объективы с увеличением х3, х5, х8,х10, х20, х40, х60, х85, х90. Объективы малого увеличения применяют для предварительного просмотра препарата, объективы среднего увеличения( х20, х40,х60) - для изучения крупных клеток микроорганизмов, объективы большого увеличения (х85,х90) – иммерсионные- для изучения внутренних структур клеток. Объективы бывают сухие и погружные ( иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объективом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает работу с ними при погружении фронтальной линзы объектива в однородную жидкую среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. При работе с иммерсионным объективом между покровным стеклом и линзами объектива помещают кедровое (касторовое) масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют направления. Окуляр служит для увеличения изображения, полученного от объектива. Окуляры обычно имеют увеличение х7, х10, х15. Увеличение объектива и окуляра указано на их оправе. Основными характеристиками объектива являются фокусное расстояние и разрешающая способность. Фокусное расстояние в отечественных микроскопах выражается в миллиметрах и, чем оно меньше, тем больше увеличение. Разрешающая способность объектива, то есть способность изображать мельчайшие детали препарата, определяется наименьшим расстоянием, при котором два близко расположенных штриха видны раздельно. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений окуляра и объектива. Осветительное устройство состоит из зеркала и конденсора. Зеркало имеет плоскую и вогнутую отражающие поверхности. Обычно при работе зеркало повернуто к свету плоской стороной. Конденсор состоит из двух линз. Линзы собирают параллельные лучи света, отраженные от зеркала, в один пучок в плоскости исследуемого препарата. Конденсор укреплен на кронштейне и может передвигаться вверх и вниз с помощью рукоятки. На нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, с помощью которой регулируют интенсивность освещения препарата. Пучок лучей от источника света попадает на зеркало, отражается через диафрагму конденсора, проходит через нее, через исследуемый препарат и попадает в объектив. Объектив дает увеличенное изображение препарата в плоскости окуляра. Механическая часть микроскопа состоит из основания и тубусодержателя, на котором укреплены предметный столик, кронштейн конденсора и зеркало. В верхней части расположены головка для насадки с окуляром и револьвер с объективами. Предметный столик служит для закрепления на нем исследуемого препарата. Фокусировка осуществляется при перемещении тубуса с помощью механизма, приводимого в движение двумя винтами – макрометрическим ( грубая настройка) и микрометрическим ( тонкая настройка). Качество микроскопа определяется его увеличительной и разрешающей способностями. Теоретически микроскоп может дать увеличение 2000х раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Пределы полезного увеличения в обычно используемых микроскопах достигают 1400х. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света, которые незаметны в пределах полезного увеличения, но приводят к оптическим ошибкам в зоне бесполезных увеличений. Разрешающая способность микроскопа определяется главным образом объективом и конденсором. 1.3.Практическая часть. 1.3.1.Знакомство с правилами работы с микроскопом. Сначала ставят объектив с малым увеличением (х8) и при этом увеличении устанавливают наилучшее освещение. Наилучшее освещение достигается при регулировке положения зеркала, конденсора и диафрагмы. При просмотре неокрашенных препаратов применяют суженную диафрагму и опущенный конденсор. При наблюдении окрашенных препаратов - открытую диафрагму и поднятый конденсор. Затем помещают препарат на предметный столик микроскопа, под объектив, и укрепляют зажимами. Опускают объектив (х8) при помощи макрометрического винта почти до соприкосновения с предметным стеклом на расстояние около 0,5 см от предметного столика. Медленно вращают макровинт против часовой стрелки до появления четкого изображения препарата, после чего наводят резкость микрометрическим винтом, который вращают в пределах одного оборота макровинта. Повернув револьвер, устанавливают объектив со средним увеличением. 1.3.2.Исследование живых клеток микроорганизмов . Препараты готовят на предметных стеклах толщиной 1,2 – 1,4 мм. Существенным моментом является подготовка поверхности предметных стекол при изготовлении препаратов. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу, а не собиралась в капельки. Наиболее надежный способ обезжиривания – обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. В повседневной работе вполне достаточно бывает тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть его чистой хлопчатобумажной тканью. Живые клетки микроорганизмов исследуют методами «раздавленной» и «висячей» капли. Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения и определения запасных веществ клетки. В обоих случаях возможно окрашивание объекта «прижизненными» красителями - метиленовой синью или нейтральным красным в концентрациях от 0,001 до 0,0001%. Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения, конденсор немного опускают, поступление света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением – объектив х8, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив х40. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, бактериологическая петля, предметные стекла, покровные стекла, спиртовки, пипетки, капельницы с водой, фильтровальная бумага. 1.3.2.1.Методика выполнения работы. Методами «раздавленная» и «висячая» капля готовят препараты крупных микроорганизмов, например дрожжей и микроскопических грибов. Для приготовления препарата «раздавленная» капля на чистое предметное стекло нанести каплю водопроводной воды. В нее внести культуру микроскопических плесневых грибов, взятую бактериологической петлей с поверхности плесневого хлеба, смешать с водой. Накрыть каплю покровным стеклом, так чтобы под ним не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижать покровное стекло к предметному и удалить избыток воды фильтровальной бумагой. Рассмотреть препарат под микроскопом. Для микроскопирования дрожжей в химическом стакане с дистиллированной водой растворить щепотку прессованных дрожжей, помешивая стеклянной палочкой суспензию. Поместить суспензию в термостат или в водяную баню при температуре 30°С и выдержать 20 минут. На чистое предметное стекло нанести пипеткой каплю полученной дрожжевой суспензии и покровным стеклом накрыть смоченную поверхность, избыток воды убирают кусочком фильтровальной бумаги. Препарат рассматривают под микроскопом. Препарат « висячая» капля применяют для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. На чистое покровное стекло нанести препаровальной иглой негустую суспензию микроорганизмов, выращенных в физиологическом растворе (0,5% раствор NaCl). Покровное стекло переворачивают и помещают на стерильное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля свободно свисала над лункой. Для герметичности края лунки смазывают вазелином. 1.3.2.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму клеток дрожжей и микроскопических грибов, расположение клеток, строение грибницы и органов размножения грибов. Написать отчет о проделанной работе. 1.4. Контрольные вопросы. 1.Что изучает морфология микроорганизмов? 2.В чем отличие прокариотой клетки от эукариотной? 3.Какое строение имеет дрожжевая клетка? 4.Какими способами размножаются дрожжи? 5.В чем отличие культурных и диких дрожжей? 6.Как происходит размножение микроскопических мицелиальных грибов? 7. Назовите признаки характерные для грибов и общие с растениями и животными. Рекомендуемая литература [1],c.3-6,33-43, [2] c.18-41 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ.
Изучение морфологии микроорганизмов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Этот метод позволяет изучить морфологические особенности клеток микроорганизмов и дает возможность найти различия между ними, а иногда – точно определить изучаемый микроорганизм. Кроме того, этот метод удобен в практической работе и легко доступен благодаря простоте техники окрашивания. Приготовление окрашенного препарата включает приготовление мазка, фиксацию мазка и окрашивание препарата. !. Приготовление мазка. Мазок должен быть тонким, так как при этом условии он удобен для изучения микробов. Мазок можно приготовить различными способами. На чистое обезжиренное предметное стекло, например, наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее исследуемый материал с помощью прокаленной бактериологической петли. Исследуемый материал слегка растирают в капле воды, а остаток культуры в петле сжигают в пламени горелки. Остудив петлю, приступают к изготовлению мазка: сначала краем петли культуру равномерно размешивают в капле, а затем круговыми равномерными движениями распределяют каплю на площади, составляющей примерно 1/3 предметного стекла. Затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или слабо нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется, так как белки коагулируют, искажая структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют. 2. Фиксация мазка. Под фиксацией подразумевают такую обработку живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в нем, сохранив тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация нужна в случае работы с патогенными микроорганизмами для безопасности. Существует несколько способов фиксации. Наиболее простым и самым распространенным в микробиологии является фиксация над пламенем горелки. В ряде случаев фиксация жаром оказывается слишком грубой. Тогда прибегают к фиксации препарата при помощи химических соединений. При этом фиксатор наливают на мазок или препарат погружают в сосуд с фиксирующей жидкостью на определенное время, а затем высушивают. Используют следующие фиксирующие жидкости метиловый спирт (2-3 минуты), этиловый спирт (10-15 минут), ацетон (5 минут), смесь равных объемов этилового спирта и эфира - по Никифорову (15 минут). Можно применять для фиксации также хромовые соединения, формалин, пары осмиевой кислоты ( несколько секунд). 3. Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания меняется от 1 до 5 минут, в отдельных случаях до 3 минут и дольше. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание препаратов микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски следует рассматривать как процесс физико-химический. Соединение протопласта микробной клетки с красителем является в большинстве случаев весьма прочным, не поддается разрушению или простому вымыванию водой. В ряде случаев различные составные части клетки избирательно окрашиваются различными красящими растворами. Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной, вторые - кислотной природы. Поскольку в белках есть основные группы (NH2¯) и кислотные (COOH¯) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями. Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: красные – нейтральный красный, сафранин, фуксин, синие – мителеновая синь, фиолетовые – генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, зеленые – метиленовый зеленый, малахитовый зеленый, коричневые – везувин, хризоидин, черные – индулин. Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые – кислый фуксин, эритрозин, черные – нигрозин, желтые – конго, флуоресцин. 2.3.Практическая часть. Существуют простые и дифференцированные способы окраски фиксированных препаратов микроорганизмов. При простой окраске используется какой либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. Прокрашивается вся клетка. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки на 1 мл, спиртовки. 2.3.1. Методика выполнения работы. Для изучения морфологии бактерий приготовить окрашенные фиксированные препараты из кефира, йогурта и мясопродуктов. При приготовлении мазки из кефира и йогурта материал прокаленной петлей нанести на середину предметного стекла. К капле придвинуть под углом 45° другое предметное стекло. Тотчас же, плотно прижимая это стекло в том же положении под углом, продвинуть его налево по предметному стеклу с исследуемым материалом. Получается равномерно распределенный по поверхности стекла мазок. Мазок высушить на воздухе. Затем зафиксировать в пламени спиртовки. Препарат захватить пинцетом и три – четыре раза медленно провести нижней стороной над пламенем (на границе светлой и темной его части). Окраску препарата провести с помощью метиленового синего. Количество краски должно покрыть всю поверхность мазка. Окраска проводится в течение 3 – 5 минут. По истечении срока окрашивания лишнюю краску слить с препарата и промыть его легкой струей водопроводной воды. Оставшуюся на стекле воду осторожно удалить фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен быть абсолютно сухим. При приготовлении препарата из мясопродуктов кусочек мяса, колбасы, печени осторожно захватить стерильным пинцетом и слегка надавить им на чистое предметное стекло, стараясь не сдвинуть в сторону (препарат «отпечаток»). Мазок высушить на воздухе и зафиксировать в пламени спиртовки также, как и в предыдущем случае. Окраску препарата провести с помощью фуксина. Количество краски должно покрыть всю поверхность мазка. Окраска проводится в течение 1 - 2 минут. По истечении срока окрашивания лишнюю краску слить и промыть препарат легкой струей водопроводной воды. Оставшуюся на стекле воду осторожно удалить фильтровальной бумагой. Приготовленные препараты поместить на предметный столик микроскопа и, пользуясь объективом х8, установить свет. Затем в центр препарата на мазок нанести каплю иммерсионного масла и заменить сухую систему иммерсионной (объектив х90). С помощью макрометрического винта опустить тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Пользуясь микрометрическим винтом, поднять тубус и, наблюдая в окуляр, найти появление изображения. Если изображение нерезкое, тусклое или плывет, что-то сделано неправильно : загрязнена фронтальная линза объектива, мешают пузырьки воздуха в масле, случайно закрыта диафрагма, сдвинуто зеркало. Причину некачественного изображения необходимо устранить. По окончании микроскопирования поднять тубус, снять препарат и осторожно протереть фронтальную линзу объектива сухой хлопчатобумажной салфеткой. Загрязнение фронтальной линзы объектива можно устранить протерев ее салфеткой смоченной очищенным бензином или ксилолом. Погружать в иммерсионную жидкость можно только иммерсионные объективы (не сухие)! |
Похожие:
 | Федеральными государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускников по |  | Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки тьюторов, стажеров, руководителей и педагогических работников школ |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму | | ... |
| Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов ифжимк юфу | | Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;... |
| Предгорненское районное местное отделение Общероссийского общественного благотворительного фонда | | Нимгирова А. С., Кульков В. Н., Набережная Ж. Б., Набережная И. Б. Организационно-теоретические аспекты экспертизы временной нетрудоспособности... |
| Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов и интернов, курсантов факультетов повышения квалификации | | Г12 Экономика отрасли (Экономика дорожного строительства): учебно-методическое пособие [Текст] / сост. В. В. Гавриш, Е. В. Гуторин.... |