Учебно-методическое пособие Дисциплина- «Микробиология»
Скачать 2.13 Mb.
|
2.3.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Написать отчет о проделанной работе.
Рекомендуемая литература [1] c.33-43, [2] c.18-41 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ И НЕГАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ. 3.1. Цель работы: приобретение навыков применения дифференцированных и негативных методов окраски препаратов микроорганизмов.
Сложные или дифференцированные способы окраски микроорганизмов основаны на особенностях физико-химичекого строения клетки. Они применяются для детального изучения клеточных структур и для характеристики и дифференциации данного микроорганизма. При дифференциальной окраске применяют несколько красителей. Наибольшее практическое значение в микробиологической практике имеют окраска по Грамму и по Циль-Нильсену. Красители делят на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают клетки (при комнатной температуре в течение 30-60 секунд), негативные – пространство, окружающее микроорганизмы. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь, капсулы), плохо выявляемые при помощи позитивных красителей, становятся хорошо заметными при окрашивании препаратов негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не окрашиваются, поэтому при окрашивании бацилл позитивными красителями они окрашиваются как бы негативным способом и имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках. 3.3.Практическая часть. 3.3.1.Окраска микроорганизмов по Грамму. Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем. У других видов это соединение неустойчиво и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмы первой группы относят к грамположительным, а второй – к грамотрицательным. Окраска по Грамму является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. Как правило, по Грамму окрашиваются клетки молодых, чаще всего суточных культур, так как способность удерживать красители зависит от физиологического состояния бактерий. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки. 3.3.1. 1.Методика выполнения работы На хорошо обезжиренное предметное стекло нанести тонкий мазок исследуемого метериала (Bacillus mesentericus, Lactococcus lactis). Мазок высушить на воздухе, зафиксировать над пламенем спиртовки и окрасить в течение 1 минуты феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклонном положении. Слить краситель и, не промывая препарат водой, нанести на него раствор Люголя на 1 минуту (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае держать в наклонном положении. Слить раствор Люголя и, не промывая водой, обработать, непрерывно покачивая, 96% спиртом в течение 15 – 20 секунд. Время воздействия спирта очень существенно, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат оказывается перекрашенным. Промыть водой препарат и окрасить фуксином Пфейфера в течение 1 минуты. Слить избыток краски и промыть водой. Высушить препарат фильтровальной бумагой и исследовать с иммерсионной системой. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные приобретают розовую окраску. 3.3.1.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Отметить грамположительные и грамотрицательные бактерии. Написать отчет о проделанной работе. 3.3.2. Выявление кислотоустойчивости у бактерий. Кислотоустойчивость - свойство характерное для микобактерий, нокардий и некоторых актиномицетов. Оно связано с особенностями химического состава клеточных стенок, главным образом с наличием в них сложных липидов и миколовых кислот. Это свойство заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Циль-Нильсену. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 5% раствор серной кислоты.. 3.3.2. 1.Методика выполнения работы На фиксированный приготовленный обычным способом мазок поместить полоску фильтровальной бумаги, обильно смочить бумагу карболовым фуксином Циля и нагреть препарат над пламенем 5 минут. Не допускать высыхания препарата, при необходимости в него добавить одну – две капли воды. Не доводить также краситель до кипения. Как только появятся пары, препарат отвести в сторону. По окончании окрашивания и охлаждения препарата бумагу удалить, а мазок промыть слабой струей водопроводной воды до исчезновения краски в стоке. Затем препарат промокнуть фильтровальной бумагой и погрузить на 3 – 5 секунд в 5% раствор серной кислоты. Снова промыть водой, промокнуть бумагой и окрасить в течение 3 – 5 минут метиленовым синим Леффлера. Препарат тщательно промыть водой, высушить и исследовать с иммерсионной системой. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые – в синий. 3.3.2.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Отметить кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Написать отчет о проделанной работе. 3.3.3. Негативный способ окраски препаратов. При этом способе окраски исследуют микроорганизмы в неокрашенном виде, в то время как фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробных клеток. На окрашенном фоне микробные клетки выделяются ярко обрисованными контурами. Один из наиболее распространенных способов негативной окраски – способ Бурри. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы раствором черной туши, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки. 3.3.3. 1.Методика выполнения работы Каплю туши поместить на хорошо обезжиренное предметное стекло , рядом с ней наносят каплю воды и в нее поместить прокаленной бактериологической петлей флору зубного налета. Обе капли быстро и тщательно перемешать . Из полученной смешанной капли приготовить мазок таким же способом, как из кефира и йогурта. Когда мазок высохнет, на него нанести каплю иммерсионного масла и рассмотреть с иммерсионной системой микроскопа. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне. При негативном способе окраски микроорганизмы остаются в препаратах в живом виде (препарат не подвергается фиксации). 3.3.3.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Написать отчет о проделанной работе.
1. В каких случаях применяют дифференцированные способы окраски бактерий? 2. Чем отличается строение и состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий? 3. Какие свойства бактерий связывают с их принадлежностью к группам грамотрицательных и грамположительных? 4. На чем основан способ негативной окраски микроорганизмов? Рекомендуемая литература [1] c.44-61, [2] c.62-71. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 ВЫЯВЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУР И ВКЛЮЧЕНИЙ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Клетки многих микроорганизмов могут быть окружены капсулой или слизью. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Для выявления капсул применяют способ негативной окраски с помощью жидкой туши. Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гранулярных цитоплазматических включений. Природа запасных веществ различна. Чаще всего это полисахариды, липиды, полифосфаты. Некоторые бактерии накапливают в клетках серу. Запасные вещества выявляются в клетках разного возраста, используя те или иные микрохимические реакции. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают более высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлее, овальные или эллипсовидные образования. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией свободной воды в ней и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах окрашенных простыми способами или по Грамму, споры остаются бесцветными. В случае выявления у микроорганизма способности к спорообразованию необходимо обратить внимание на тип спорообразования, расположение споры в клетке, форму свободных спор и определить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2 – 3 суточной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития – от вегетативной клетки до свободной споры. Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения на фоне споры. 4.3.Практическая часть 4.3.1. Окраска включений клеток микроорганизмов. Запасные вещества в клетках микроорганизмов (включения) могут быть представлены гранулами полисахаридов. В клетках дрожжей накаливаются включения гликогена. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде. Углевод гранулеза (крахмалоподобное вещество) накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Объектом исследования может служить накопительная культура маслянокислых бактерий. Ее получают следующим образом на трое-четверо суток до занятия в пробирки помещают мелко нарезанный неочищенный картофель (1/3 пробирки), на кончике ножа вносят мел и доливают до верху водопроводной водой. Пробирки помещают на водяную баню при 70° С нагревают 10 минут, затем охлаждают и ставят в термостат при 30° С. Запасное вещество микроорганизмов может быть представлено также полифосфатами – валютином. Валютин представляет собой запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. Характерное его свойство – сродство к основным красителям и метахромазия, то есть способность приобретать иной цвет, чем цвет окрашиваемого вещества. В клетках прокариот валютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот – в вакуолях. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 1% раствор серной кислоты. 4.3.1. 1.Методика выполнения работы Окраска гранул. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю раствора Люголя. Препарат покрыть покровным стеклом и микроскопировать с сухими объективами х8, х40. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий цвет, а гранулы гликогеноподобных – в красновато-коричневый. Окраска валютина и метахроматина. Для выявления валютина у дрожжей применяют следующий способ. Фиксированный в пламени спиртовки мазок окрасить метиленовым синим в течение 3 минут. Краситель слить, препарат промыть водой и не высушивая, нанести на мазок небольшую каплю 1% раствора серной кислоты. Мазок покрыть покровным стеклом и микроскопировать с сухими объективами х8, х40. Для выявления валютина у бактерий используют метод Омелянского. Приготовить тонкий мазок клеток, высушить его на воздухе, зафиксировать в пламени спиртовки. На фиксированный мазок налить карболовый фуксин и окрашивать клетки в течение 1 минуты. Краску слить, промыть препарат водой и обесцветить 1% раствором серной кислоты в течение 20 – 30 секунд. Затем кислоту слить, препарат промыть водой и дополнительно окрасить 30 секунд метиленовым синим. Снова промыть водой, высушить и микроскопировать с иммерсионной системой. Гранулы валютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы. 4.3.1.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради включения полисахаридов и валютина в микробных клетках. Написать отчет о проделанной работе. 4.3.2.Окраска спор у бактерий. В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочки для окраски спор применяют сначала химические вещества, меняющие структуру оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Чтобы добиться прокраски только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, отнимая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Это легко достигается, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем адсорбированный цитоплазмой клетки. Поэтому все способы окраски спор основаны на едином принципе. Сначала споры протравливают разными веществами (хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода), затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и обесцвечивают цитоплазму, а потом дополнительно окрашивают ее контрастным красителем. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 1% раствор серной кислоты, 5% раствор хромовой кислоты. 4.3.2. 1.Методика выполнения работы Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера. До фиксации мазка на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный и остывший препарат нанести 5% раствор хромовой кислоты. Через 5 – 10 минут кислоту смыть водой. Препарат покрыть полоской фильтровальной бумаги, обильно смочить бумагу карболовым фуксином Циля. Подогреть препарат в пламени спиртовки до появления паров (не до кипения), отвести в сторону и добавить новую порцию красителя. Так в течение 7 минут. При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения бумагу снять, препарат промыть водой и тщательно промокнуть фильтровальной бумагой. Далее провести обесцвечивание цитоплазмы клеток, обработать препарат 1% раствором соляной или серной кислоты 16 -18 секунд для бактерий Bacillus mesentericus. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. 4.3.1.2. Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради споры бактерий. Написать отчет о проделанной работе.
|
Похожие:
 | Федеральными государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускников по |  | Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки тьюторов, стажеров, руководителей и педагогических работников школ |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму | | ... |
| Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов ифжимк юфу | | Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;... |
| Предгорненское районное местное отделение Общероссийского общественного благотворительного фонда | | Нимгирова А. С., Кульков В. Н., Набережная Ж. Б., Набережная И. Б. Организационно-теоретические аспекты экспертизы временной нетрудоспособности... |
| Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов и интернов, курсантов факультетов повышения квалификации | | Г12 Экономика отрасли (Экономика дорожного строительства): учебно-методическое пособие [Текст] / сост. В. В. Гавриш, Е. В. Гуторин.... |