Учебно-методическое пособие Дисциплина- «Микробиология»
Скачать 2.13 Mb.
|
Приборы, реактивы, посуда: колбы для приготовления сред, химические стаканы на 100 мл, стеклянные шпатель, термометр, набор минеральных солей, глюкоза, пробирки. 8.3.1.Методика выполнения работы Изучение сбраживания углеводов. Способность разлагать различные виды углеводов с образованием альдегидов, кислот и газообразных продуктов (CO2, H2, CH4) обнаруживается при посеве на жидкие питательные среды Гиса с различными углеводами и реактивом Андреде или лакмусовой настойкой в качестве индикатора. Приготовить среды Гиса с различными углеводами (лактозой, глюкозой, мальтозой, манитом), как указано в прописи на этикетках сред. Среды разлить в четыре пробирки. После остывания сред произвести в них посевы молочнокислых, спорообразующих бактерий, дрожжей и плесневых грибов. Микроорганизмы культивировать в термостате при температуре 30°С. 8.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе. 8.4.Контрольные вопросы 1. Какие свойства микроорганизмов исследуют при изучении их физиолого-биохимических свойств? 2. На каких средах изучают способность микроорганизмов к сбраживанию углеводов? 3. Какие продукты гниения вы знаете? Как проводят обнаружение этих продуктов? Рекомендуемая литература [1] c.90-104, [2] c.118-123 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9 ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ. 9.1. Цель работы: приобретение навыков выделения чистой культуры микроорганизмов.
Чистой культурой микроорганизмов называют такую культуру, которая получена из одной клетки и содержит микробы одного вида. Для выделения чистых культур аэробных бактерий делают высев на чашки Петри из накопительной культуры. Ее каплю (лучше из соответствующего разведения) наносят и осторожно распределяют стерильным стеклянным шпателем по поверхности плотной среды, после чего этим же шпателем протирают поверхность последующих трех- четырех чашек. Чашки выдерживают от двух до семи суток, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной плотной среды или в жидкую среду. Высев из накопительной культуры микроорганизмов, относящихся к факультативным анаэробам для получения изолированных колоний делают методом глубинного посева в пробирки со столбиком стерильного агара. Стерильной иглой берут чистую культуру из колоний, одновременно вынимают пробку, обжигают края пробирки, держа ее вверх дном, и иглой над горелкой делают прокол до дна. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий по методу Коха возможно только при ограничении доступа кислорода. 9.3. Практическая часть После того, как получена накопительная культура, приступают к выделению чистой культуры. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии и из одной клетки. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, набор красителей, МПА, чашки Петри. 9.3.1.Методика выполнения работы 1. Убедиться в получении накопительных культур микроорганизмов. О получении накопительных культур свидетельствуют :
3. Получить изолированные колонии споровых аэробных бактерий (Bacillus mesentericus). Для этого взять прокаленной петлей материал из бактериальной пленки, перенести его в пробирку со стерильной водой и тщательно перемешать. Из полученной суспензии провести рассев петлей нм поверхности МПА в чашке Петри методом «истощающего штриха». Чашки Петри поместить в термостат при температуре 30°С. 9.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе. 9.4.Контрольные вопросы 1. Какие вам известны способы выделения чистых культур? 2. В чем заключается метод Коха? 3.Чем отличается методика выделения чистых культур аэробных микроорганизмов от методики выделения факультативных анаэробов? 4. Каким образом выделяют чистую культуру из одной клетки? Рекомендуемая литература [1]c.61-75, [2] c.106-114 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 10 ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов самые различные соединения полисахаридвы, белки, нуклеиновые кислоты, липиды и другие. Однако макромолекулы не могут проникнуть через мембрану клеток. Они подвергаются гидролизу, который осуществляется под действием ферментов гидролитического действия. Большинство из них катализирует гидролиз полимеров до растворимых продуктов, обычно димеров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных механизмов. Образование экзоферментов широко распространено среди представителей различных групп микроорганизмов. При поиске продуцентов ферментов гидролаз в лабораторной практике используют специальные методы, сущность их состоит в в том, что при выращивании микроорганизмов в агаризованной среде, содержащей макромолекулярный субстрат, в случае выделения в среду экзоферментов, гидролизующих данное соединение, выросшие колонии окружены зоной, в которой обнаруживаются продукты гидролиза.
Среди биохимических свойств культуры наиболее важным является определение ее ферментативной активности. Активность протеаз устанавливают, во-первых. По разжижению желатина, учитывая скорость и характер разжижения при уколе столбика желатина, во-вторых, по свертыванию и пептонизации молока, то есть отмечают кислотность по покраснению синей лакмусовой бумажки, образование устойчивого сгустка и коагуляцию с последующей пептонизацией, пептонизацию без предварительного свертывания, а также склорость происходящих изменений. Активность амилазы определяют по величине зоны гидролиза крахмала, для этого делают пробы с раствором Люголя. Активность целлюлазы устанавливают по степени распада целлюлозы на среде Гетчинсона, активность сахаразы – по гидролизу сахарозы при действии реактива Фелинга, который окисляет альдегидные соединения, при этом оксид меди переходит в закись. Приборы, реактивы, посуда: бактериологическая петля, фильтровальная бумага, МПА, желатин, молоко, агар. штатив с пробирками, водяная баня, крахмал, молоко. 10.3.1.Методика выполнения работы 1. Амилолитическая активность. Крахмал подвергается гидролитическому расщеплению под действием амилаз, активными продуцентами которых являются различные виды бацилл, псевдомонад, стрептомицетов и мицелиальных грибов. Для выявления амилолитической активности используют среду следующего состава (г/л): пептон - 1,0; КН2РО4 - 0,5; растворимый крахмал - 0 , 2; агар - 1,5; рН среды - 6,8-7,0. Среды залить в стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, исследуемые бактерии высеять штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования 2-10 суток. Гидролиз крахмала обнаруживают после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Для этого на поверхность среды налить 3 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измерить в мм от края штриха (колонии) до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше амилолитическая активность. 2. Протеолитическая активность. Протеолитические ферменты (протеазы) катализируют расщепление белков на фрагменты: поли- и олигопептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, актиномицетов мицелиальных грибов и других групп микроорганизмов. Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качестве субстрата желатин, казеин и другие белки. а) Протеолиз желатина. Культуру высеивают на мясопептонную желатину (МПЖ). Среду готовят следующим образом: к 30 мл МПБ добавляют 3,0 г желатина, оставляют на 20 минут, чтобы желатин набух, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатина и разливают в пробирки по 5-8 мл. Посев провести уколом. Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатина или его отсутствие отмечают визуально. Если желатин разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения - послойное, воронкообразное, пузырчатое и так далее. б) Протеолиз казеина. Для выявления этой способности используют молочный агар - среду состоящую из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного 3%-ного водного агара. Перед приготовлением среды молоко обезжирить центрифугированием в течение 15 минут при 2-3 тыс. об./мин. Жиры, которые образуют на поверхности молока плотную пленку, удалить, а молоко простерилизовать. Затем его добавить при постоянном помешивании к стерильному водному агару. Полученную среду разлить в чашки Петри. Бактерии высеять штрихом по диаметру чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2-10 суток. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или выросших по штриху микроорганизмов. Особенно четко она видна после обработки среды раствором 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Зоны гидролиза казеина измерить в мм от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем больше диаметр активность бактерий. Типы разжижения желатина:  10.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе. 10.4.Контрольные вопросы 1. Что такое ферменты? 2. Какие ферменты образуются в клетках микроорганизмов? 3. Как выявляют амилолитическую и протеолитическую активность? 4. Какие факторы влияют на ферментативную активность микроорганизмов? Рекомендуемая литература [1]c.7-29, [2] c.87-103 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ МИКРООРГАНИЗМОВ
Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами – визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред. Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого приготовить препарат фиксированных клеток и просмотреть его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть его. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий, например, микробактерий, нокардий и других, полиморфные, поэтому определение чистоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения. Чистоту культуры микроорганизмов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Прежде всего выделенную культуру высевают на плотную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний – свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на МПА – среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний, или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на МПА не развиваются. Следуют иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом еще на ряд сред – сусло, мясопептонный бульон, картофельный агар и другие. Набор сред и их состав определяются особенностями метаболизма выделенных микроорганизмов, а также их возможных спутников.
К культуральным свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Рост на плотных питательных средах На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшие в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитывают следующие признаки: форму колонии - округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и другие (рис. 54); размер (диаметр) колонии измеряют в мм; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными; поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; п  рофиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и так далее (рис.55);блеск и прозрачность - колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят бесцветным) или пигментированная - белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо выделяют выделение пигмента в субстрат ; край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и так далее; структуры колонии - однородная, мелко- или крупно-зернистая, струйчатая и так далее. Край и структуру колоний определяют с помощью лупы или при мелком увеличении микроскопа. Для этого чашку помещают на столик микроскопа крышкой вниз; к  онсистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистый (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимаются целиком), крепкой (легко ломается при прикосновении петлей).самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну. Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более и менее сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Лишь глубинные колонии немногих бактерий напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную- среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если развивающиеся микроорганизмы выделяют углекислоту  Рис 54 Форма колоний: а - круглая, б - круглая с фестончатым краем, в - круглая с валиком по краям, г, д - ризоидные, е - круглая с ризоидным краем, ж - амебовидная, з - нитевидная, и - складчатая, к - неправильная, л - концентрическая, м - сложная  Рис.55. Профиль колоний: а - изогнутый; б - кратерообразный; в - бугристый; г -врастающий в субстрат; д - плоский; е - выпуклый; ж - каплевидный; з - конусовидный. Размеры и некоторые другие особенности колонии изменяются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования. При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный; сплошной с ровным или волнистым краем; четковидный, напоминающий цепочку изолированных колоний; диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию. Рост в жидких питательных средах. Рост микроорганизмов в жидких средах более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост в жидкой среде отличают степень помутнения - слабая, умеренная или сильная; особенности пленки - тонкая плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, а при образовании осадка указывают - скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный. Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп; предметные и покровные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, набор красок, раствор Люголя, иммерсионное масло. 11.3.1.Методика выполнения работы Просмотреть чашки Петри, засеянные на предыдущем занятии. Подсчитать число выросших колоний. Отобрать 2-3 изолированные колонии, описать их, зарисовать. Изучить морфологию клеток отобранных культур, приготовив препараты "раздавленная петля". Обратить внимание на подвижность, форму и соединение клеток бактерий . Результаты оформить в виде таблицы. Культуральные и морфологические особенности исследуемых бактерий.
1. Что такое чистая культура? 2. Какими способами можно определить чистоту выделенной культуры? 3. Что такое культуральные признаки микроорганизмов? Рекомендуемая литература [1] c.61-75 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.
Число клеток в единице объема можно определить непосредственным подсчетом их под микроскопом. Для этого пользуются счетными камерами, капиллярами Перфильева, препаратами фиксированных и окрашенных клеток, приготовленных на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема. Следует помнить, что подсчитываются все клетки, как живые, так и мертвые.
Метод подсчета клеток рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева - Тома. Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм (большой квадрат) или 1/400 мм (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сетка, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры; она всегда указывается на предметном стекле. При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным раствором покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны для появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. При этом условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Число клеток подсчитывается с объективом х8 или х40. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому попечет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:  где М – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в квадрате сетки; h – глубина камеры в мм; S – площадь квадрата сетки; 10 – коэффициент перевода в см мм; n – разведение исследуемой суспензии. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, счетная камера Горяева; бактериологическая петля; стерильные петли на 0,1-0,2; 1 мл, термометр, электроплита. 12.3.1.Методика выполнения работы Приготовить дрожжевую суспензию в химическом стакане. Пользуясь счетной камерой Горяева - Тома посчитать количество клеток дрожжей в 1 мл культуры. Сравнить интенсивность роста дрожжей при разной температуре, пользуясь счетной камерой. 12.3.2. Оформление работы. Рассчитать количество клеток дрожжей пользуясь приведенной выше формулой. Написать отчет о проделанной работе. 12.4.Контрольные вопросы 1. Какие вам известны способы подсчета клеток микроорганизмов? 2. Что представляет собой камера Горяева – Тома? Рекомендуемая литература [1]c.209-238 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13 ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ.
Употребление в пищу продуктов обсемененных микробами или зараженных токсинами микроорганизмов может привести к пищевым отравлениям. Пищевые токсикоинфекции вызываются :
Чтобы не допустить пищевых отравлений на предприятиях пищевой промышленности проводят микробиологический контроль пищевых продуктов.
Объектами исследования могут быть различные пищевые продукты и приготовленные из них блюда (мясо, рыба, колбаса, консервы, молочные изделия, холодные блюда и другие). Для исследования продуктов твердой консистенции берут пробы с поверхности и из глубины. Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, набор красителей , иммерсионное масло, среда Эндо, молочно-солевой агар( к 100 мл МПА, содержащего 6,5% поваренной соли, перед употреблением 10 мл снятого стерильного молока, рН 7,4). 13.3.1.Методика выполнения работы С поверхности пищевого продукта (мясо, колбаса) сделать соскоб стерильным скальпелем с разных мест. При взятии проб из глубины кусок пищевого сырья (5 – 10 г) обжечь или погрузить на 5 минут в кипящую воду. Затем разрезать его пополам, взять из центральной части небольшой кусочек (1 – 3 г) и сделать препараты отпечатки на стерильном предметном стекле , провести окраску по Грамму. Кроме того произвести посевы на среде Эндо путем прикосновения поверхностью кусочка. Если при микроскопировании препаратов-отпечатков обнаруживается много микроорганизмов, то перед посевом исследуемый кусочек растереть в ступке и из полученной кашицы сделать посев штрихом или шпателем в чашках со средой Эндо. Продукты жидкой консистенции забирают для посева стерильными пипетками. При исследовании консервов произвести тщательную стерилизацию поверхности банки. Перед посевом обжечь в пламени одну из сторон банки, где сделать затем стерильным ножом отверстие, через которое стерильной пипеткой взять материал для исследования. При исследовании жидкостей посевы произвести как непосредственно из жидкости, так и из осадка в ней после центрифугирования. Для обнаружения стафилококка проводят микроскопию мазков и посев материала (крем кондитерских изделий и молочные продукты) на молочно-солевой агар. 13.3.2. Оформление работы. Зарисовать в тетради форму клеток микроорганизмов. Написать отчет о проделанной работе. 13.4.Контрольные вопросы 1. Что является причиной пищевых интоксикаций? 2. Какие вам известны пищевые токсикоинфекции? 3. Какие пищевые инфекции вам известны? 4. Какие микроорганизмы относят к санитарно-показательным? Рекомендуемая литература [1] c. 172-188 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 14 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА – ПРОБА НА РЕДУКТАЗУ.
Для определения редуктазы отбирают среднюю пробу молока после органолептической оценки. Тщательно перемешивают. Отбирают 50 мл в стерильную колбу, которую закрывают стерильной пробкой. Микробиологическое исследование проводят тот час же или не позднее 4 часов с момента отбора проб.
Приборы, реактивы, посуда: пробирки, метиленовый голубой, молоко, водяная баня, термометр. 14.3.1.Методика выполнения работы Проба на редуктазу является косвенным показателем обсемененности непастеризованного молока. В пробирки налить по 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и по 20 мл исследуемого молока, закрыть пробками и смешать путем медленного трехкратного переворачивания. Пробирки поместить на водяную баню при температуре 38°С. Вода в водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Момент погружения пробирок в водяную баню считать началом анализа. Наблюдение за изменением окраски проводить через 20 минут, через 2 часа. Через5,5 часов после начала анализа. Окончанием опыта считать момент обесцвечивания окраски молока. В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из классов .
14.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе. 14.4.Контрольные вопросы 1.Что показывает проба на редуктазу? 2.В чем заключается методика определения пробы на редуктазу? Рекомендуемая литература [1]c.277-315 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 15 ЭПИФИТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ЗЕРНА
На поверхности зерна обитают разнообразные микроорганизмы. Часть из них попадает туда из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми. Однако на зерне, как и на прочей поверхности растений, развиваются лишь отдельные виды микроорганизмов, называемые эпифитами. Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений, получили название микроорганизмов филлосферы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений; устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов, выдерживают периодические колебания влажности. Численность этих микроорганизмов невелика, и видовой состав их довольно постоянен: более 90 % составляют гнилостные бактерии, в основном неспороносные бактерии (род Pseudomonas). Особенно часто на зерне встречается Р. herbicola (Erwinia herbicola), образующая на плотных средах золотисто-желтые колонии. Встречаются также Р. fluorеsсеns, микрококки, молочнокислые бактерии, дрожжи. Бацилл и микроскопических грибов немного. В определенных условиях эпифитные микроорганизмы могут быть и полезны для растений, так как препятствуют проникновению паразитов в ткани растения. На хранении зерна присутствие эпифитных микроорганизмов может сказываться отрицательно. На развитие микроорганизмов на зерне, а следовательно, на сохранность последнего решающее влияние оказывают: влажность, температура, степень аэрации, целостность зерна и состояние его покровных тканей. В зрелом зерне вода находится в связанном состоянии и недоступна микроорганизмам, которые в этом случае находятся в состоянии анабиоза (покоя). На зерне с повышенной влажностью микроорганизмы размножаются и тем быстрее, чем выше температура. Развитие микробиологических процессов на хранящемся зерне с повышенной влажностью приводит к заметному, а иногда и очень значительному повышению температуры. Это явление получило название "термогенез". Самосогревание зерна ведет к смене микрофлоры. Свойственная зерну эпифитныеI микрофлора исчезает. Начинают обильно размножаться непигментированные неспороносные палочки, вытесняющие Erwinia herbicola. Позднее появляются термостойкие (термотолерантные) микрококки, на плотных средах чаще всего образующие мелкие белые плоские колонии, а также плесневые грибы, актиномицеты. Самосогревание свыше 40...50°С способствует развитию спорообразующих и термофильных бактерий. По мере самосогревания изменяется видовой состав и плесневых грибов. Виды Реniсillium преобладающие вначале, заменяются представителями рода Aspergillus. Таким образом, по видовому составу микрофлоры можно судить не только о том, подвергалось ли зерно самосогреванию, но и насколько далеко зашел этот процесс. Преобладание Erwinia herbicola в микробном ценозе зерна служит показателем его хороших качеств. Большое количество спорообразующих бактерий и грибов указывает на потерю семенами всхожести. Кроме порчи самого зерна благоприятные условия для развития на его поверхности микроорганизмов приводят к накапливанию выделяемых ими токсинов. При скармливании такого зерна скоту и домашней птице возникают отравления. Таким образом, правильное хранение зерна сводится к тому, чтобы не допускать развития на нем микроорганизмов.
Приборы, реактивы, посуда: зерно в колбах - свежее и хранившееся в условиях повышенной влажности, весы, часовые стекла, колбы со стерильной водой (по 90 мл), колбы со стерильной водой (по 50 мл) и песком, стерильные пипетки Мора на 10 и 1 мл, стерильные чашки Петри, МПА в пробирках и колбах, водяная баня, микроскопы и все необходимое для микроскопирования. 15.3.1.Методика выполнения работы Количественный учет микроорганизмов на зерне. Навеску массой 5 г поместить в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды и 2...3 г песка. Колбу взбалтать круговыми вращательными движениями 10 мин. Из полученной вытяжки приготовить разведения (10  ; 10 ; 10 ). Отдельными стерильными пипетками Мора взять по 10 мл суспензии и перенести в колбы, содержащие по 90 мл стерильной водопроводной воды. Затем из каждой колбы взять по 1 мл суспензии соответствующего разведения в стерильные чашки Петри в двух повторностях. В каждую чашку Петри вылить по одной пробирке расплавленного, но предварительно охлажденного до 50 °С МПА. Чашки инкубировть при 30° С. Наряду с МПА используют элективные среды .Через три-пять дней инкубации подсчитать общее число колоний, выросших на МПА в чашках, и рассчитать количество микроорганизмов на 1 г зерна. Определение качественного состава микрофлоры зерна. Колонии сгруппировать по культуральным признакам. Из каждой группы колоний приготовить препараты, выявить принадлежность микроорганизмов к роду или семейству и определить численность бактерий каждой группы в процентах общего числа микроорганизмов. На основании микробиологического анализа сделать заключение о качестве зерна. На свежем доброкачественном зерне преобладает Erwinia herbicola (до 80 %), образующая блестящие оранжевые колонии. Встречается Pseudoтoпas fluoresceпs, формирующая желтовато-зеленоватые флуоресцирующие колонии; непигментированные неспорообразующие палочки; дрожжи - блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона колонии. При учете на сусло-агаре с мелом выявляются молочнокислые бактерии, образующие чечевицеобразные мелкие колонии с зонами растворения мела. На несвежем зерне, хранившемся при повышенной влажности, Erwiпia herbicola, Pseudoтoпas fluoresceпs не выявляются. Обнаруживаются микрококки, образующие мелкие белые блестящие плоские колонии; спорообразующие палочки; актиномицеты, а также неспороносные палочки. При учете на сусло-агаре выявляется значительное количество грибов, главным образом относящихся к роду Peпicillium, а также Aspergillus. 15.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе. 15.4.Контрольные вопросы 1.Что показывает проба на редуктазу 1.Какие микроорганизмы относят к эпифитам? 2. Какую группу микроорганизмов называют фитопатогенными? 3. Какие эпифиты характерны для зерна злаковых культур? Рекомендуемая литература [1] c.209-238 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ДРОЖЖЕЙ И МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЛУФАБРИКАТАХ. 16.1. Цель работы: приобретение навыков определения количества микроорганизмов полуфабрикатах.
Для учета количества дрожжей и молочнокислых бактерий в полуфабрикатах принят метод прямого подсчета Бургвица, или постоянно окрашенных препаратов.
Приборы, реактивы, посуда этиловый спирт 96%, формалин, метиленовый синий, полуфабрикат (закваска, тесто, жидкие дрожжи), вода. 16.3.1.Методика выполнения работы Отвесить 10 г полуфабриката. Тщательно размешать его и поместить в фарфоровую чашку. Отмерить мерным стаканом 500 мл водопроводной воды и постепенно добавлять воду к полуфабрикату, тщательно растирая его стеклянной палочкой. Полученную суспензию перенести в колбу вместимостью 1 л, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 1 минуты. При этом разрушаются скопления микробных клеток и клетки отделяются от частичек муки. Каплю полученной взвеси наносят мерной пипеткой на камеру Горяева-Тома . Препарат подсушивают на воздухе и фиксируют спиртом с формалином (75% 96% спирта и 1,95 формалина). Высохший препарат окрасить метиленовым синим и выдержать 10 – 15 минут. Затем осторожно промыть под струей воды и высушить. Препарат поместить на предметный столик микроскопа и с объективом х40 просмостреть 50 полей зрения с интервалами между каждым полем зрения в одном ряду 2 мм и между рядами 4 мм. В каждом поле зрения посчитать количество дрожжей и бактерий и суммировать их. Количество клеток дрожжей и бактерий в 1 г полуфабриката определить по формуле N=nPQ/pqg, Где n- среднее арифметическое число клеток в одном поле зрения, P- площадь препарата, Q- количество воды, взятое на разбавление пробы, мл, p- площадь поля зрения микроскопа, мм2, q- объем капли взвеси, мл, g- количество взятого полуфабриката (10 г). Для определения объема капли взвеси отсчитать 10 капель. Объем одной капли составит 0,1 общего количества жидкости, выпущенной из пипетки 16.3.2. Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе.
1. Расскажите методику подсчета количества дрожжей и молочнокислых бактерий в полуфабрикатах. Рекомендуемая литература [1]c.239-276 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ Рецепты приготовления некоторых красителей и растворов. 1.Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор: фуксин основной – 10 г, этанол 96% - 100 мл. 2. Фуксин основной карболовый (Циля): 5% водный раствор свежеприготовленного фенола -100 мл, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного – 10 мл. Приготовленную смесь через 48 часов отфильтровывают. Краситель отличается устойчивостью. 3. Фуксин основной водный раствор: карболовый фуксин Циля – 1 мл, вода дистиллированная -9 мл. Водный фуксин готовят непосредственно перед употреблением , он не стоек. 4. Метиленовый синий, насыщенный раствор: метиленовый синий – 3 г, 96% этанол – 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают (взбалтывают), затем фильтруют. Раствор устойчив. 5. Генциановый фиолетовый карболовый раствор: 1 – генциановый фиолетовый – 1 г, этанол 96% - 10 мл, раствор 2 – 5% водный раствор свежеприготовленного фенола – 100 мл. После полного растворения генцианового фиолетового растворы смешивают. 6.Раствор Люголя в модификации Грамма: Йод кристаллический – 1 г, калий йодистый – 2 г, вода дистиллированная – 300 мл. В ступку емкостью 30-50 мл помещают навеску йода и йодистого калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды и продолжая растирать кристаллы, добавляют еще 5 мл воды. Йод растворяется в йодистом калии. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем до 300 мл. Раствор хранить в темной посуде не более 30 дней. 7. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический – 1 г, калий йодистый – 3 г, вода дистиллированная – 300 мл. Раствор готовят также , как предыдущий. 8. Приготовление туши для негативной окраски: тушь черная – 10 мд, вода дистиллированная - 30 мл. Разведенную тушь центрифугируют, надосадочный слой разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм. 9. Реактивы для крахмало-йодной пробы: крахмал – 0,4 г, хлористый цинк – 2,0 г, вода – 100 мл. Хлористый цинк растворяют в 10 мл воды, кипятят и добавляют крахмал. Доводят объем до 100 мл и оставляют стоять неделю. Затем раствор фильтруют и добавляют равный объем 0,2% раствора йодистого калия. 10. Подготовка предметных и покровных стекол для препаратов. Новые стекла обычно кипятят в 1% растворе соды, затем промывают дистиллированной водой, слабым раствором соляной кислоты и вновь дистиллированной водой. Стекла, бывшие в употреблении, кипятят в мыльной воде и затем не менее суток выдерживают в растворе хромовой смеси. От бихромата стекла отмывают в дистиллированной воде. Чистые стекла хранят в 96% этаноле. 11. Хромовая смесь. Хромовокислый калий растворяют в воде, затем в раствор осторожно добавляют серную кислоту. Смесь готовят из расчета вода – 100 мл, двухромовокислый калий – 6 г, серная кислота (плотность 1,84) – 100 мл. Хромовая смесь сильно разрушает ткани животного и растительного происхождения, поэтому работать с ней необходимо очень осторожно. Если смесь попала на руку или одежду, то пораженное место немедленно следует обмыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором аммиака или соды и снова водой. Тесты. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Федеральными государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускников по |  | Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки тьюторов, стажеров, руководителей и педагогических работников школ |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму | | ... |
| Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов ифжимк юфу | | Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;... |
| Предгорненское районное местное отделение Общероссийского общественного благотворительного фонда | | Нимгирова А. С., Кульков В. Н., Набережная Ж. Б., Набережная И. Б. Организационно-теоретические аспекты экспертизы временной нетрудоспособности... |
| Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов и интернов, курсантов факультетов повышения квалификации | | Г12 Экономика отрасли (Экономика дорожного строительства): учебно-методическое пособие [Текст] / сост. В. В. Гавриш, Е. В. Гуторин.... |