Учебно-методическое пособие Дисциплина- «Микробиология»

ГЛАВА 4 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в ла­бораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изуче­ния и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности. ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на пита­тельных средах, поэтому питательная среда должна содержать все ве­щества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для био­синтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процес­сы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разно­образны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Основными компонентами любой питательной среды для культиви­рования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред. По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту - соединение, содержа­щее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекисло­той, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интен­сивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NаНС) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаС). В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5% углекислоты. Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удов­летворены только углекислотой. Для их развития среда должна содер­жать органические соединения. В зависимости от индивидуальных осо­бенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различ­ные соединения yглepoдa - кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроор­ганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudoтonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соедине­ния углерода, Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол. ­ Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино(-N) или имино(-NН)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источни­ке азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими сое­динениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NCl или (N)S. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли – физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион со­ответствующей кислоты. Что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроор­ганизмов. Гидроксид аммония (NНОH) в качестве источника азота используют редко, пocкoльку он вызывает сильное подщелачивание питательных сред. ­ Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирова­ния таких микроорганизмов содержат КNО или NaNО. В отличие от солей аммония нитраты - физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона NО- в среде накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсич­ны, поэтому в качестве источника азота почти не используются. Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими био­синтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL- ­форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллирован­ной воде, фенилаланин и триптофан - в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты - цистин и цистеин, а также амиды - глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно сте­рилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, ка­зеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с терпкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лабаратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентри­рованной HSO и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 атм. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6н раствора НСl, и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до рН 7, фильтруют; через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким спосо­бом, составляет 700 – 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в та­ком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10-30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 0,1 до 1,0 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного рас­щепления- пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и ми­кроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитиче­ских ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. В отечественных лабора­ториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-жел­того цвета, полностью растворимый в воде; 1 %-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л. Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорга­низмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии. Некоторые бактерии способны использовать в качестве единствен­ного источника азота молекулярный азот - N. Это азотфиксаторы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота. Помимо источников углерода и азота многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокнслоты. Для того чтобы подчеркнуть потребность, микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по гене­тике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В), пантотенат Са, рибофлавин (витамин B), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин B) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобен­зойная кислота - по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин - 0,005 мкг на 1 мл среды. Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в кото­рых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Paстворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистилированную воду. Исключение составляют рибофла­вин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 н уксусной кислоте, а фолиевую кислоту - в 0,01 н NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина реко­мендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре +4 растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты. пиридоксина и рибофлавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны. Примерами смесей, содержащих факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат - в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5-30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт имеется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают водой и перемешивают до получения го­могенной массы, затем добавляют несколько кристаллов тимола или 1-2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50-55 3 суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, используя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определяют фор­мальным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют при 0,5 атм 15 мин и сохраняют в холодильнике. Кукурузный экстракт - готовый продукт заводов крахмало-паточ­ной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, достаточно большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды от 0,5 до 5 г на 10 мл; стерилизуют при 0,5 атм. Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорга­низмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлет­воряются обычно за счет минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганиз­мов может быть близким по составу. Так, потребности подавляющего большинства микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроор­ганизмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего NaS, или органические соединения, содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин. Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорга­низмов в фосфоре. Все необходимые металлы - К, Na, Са, Mg, Fe, Мn, Co, Сu - и другие элементы микроорганизмы получают в форме катио­нов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит MgSO источником натрия и хлора - NaCl, кальция - СаСОили CaCl. Железо добавляют к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата. Для того чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтeтраацетат (ЭДТА) или гексаметафосфат натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые этими соедине­ниями с катионами, служат резервом, из которого в результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы. Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно боль­ших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в состав пи­тательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элементы, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг дo l мкг на 1 л; более высо­кие концентрации могут быть токсичны. Питательные среды с пепто­ном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом ка­зеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэтому предложены различные по составу смеси микроэлементов. Смесь микроэлементов по Дрюсу (Drews, 1976), мг: ЭДТА Na-800; MnCl*4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2НО - 3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0;- 0,5; НВО - 1, КВг-2; KJ -2; BaCl-0,5; вода дистиллированная-1000 мл; рН 6,0. На 1 л среды добавляют от 5 до 10 мл этого раствора. Cмесь микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1965), мг: ЭДТА-500; FeSO*7 HO-200; ZnSO*7 HО-10; МnСl.4 HО-3; НВО­-30; CoCl*2 HO - 20; CuCl*2 HO - 1; NiCl*6 HO - 2; NaMoO*2 HО - 3; вода дистилированная - 1000 мл. На 1 л среды добав­ляют от 1 до 10 мл этого раствора. Растворы микроэлементов рекомен­дуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосредственно пе­ред ее засевом. Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы принято делить на две основные группы: хемотрофы и фототрофы. Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие как HS, S или другие не вполне окисленные соединения серы, H, NH+, NO- или Fe. Эти соединения в средах для культивирования хемолитотрофных бактерий выполняют прежде всего функцию энергетического материала. Для хемоорганотрофов энергетическим субстратом служат органи­ческие вещества, которые обычно играют двоякую роль, являясь одно­временно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических про­цессов нуждаются в разных соединениях. Например, гомоферментатив­ные молочнокислые бактерии получают энергию при сбраживании са­харов, но почти не используют их в процессах биосинтеза. Для конст­руктивных целей им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, витамины. Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить по­требности этих бактерий в энергии, их культивируют при дневном или искусственном освещении. По составу принято выделять естественные или натуральные сре­ды неопределенного состава и синтетические среды.

Похожие:

	Учебно-методическое пособие дисциплина: оп 7 фармакология тема: «Антибиотики» Федеральными государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускников по		Учебно-методическое пособие Рязань 2012 Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки тьюторов, стажеров, руководителей и педагогических работников школ
	Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму		Организация и технология документационного обеспечения управления учебно-методическое пособие ...
	Бакалавра. Учебно-методическое пособие по написанию и защите вкр... Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов ифжимк юфу		Учебно-методическое пособие Казань 2010 Печатается по рекомендации... Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;...
	Учебно-методическое пособие (материалы для тренинга) Ставрополь,... Предгорненское районное местное отделение Общероссийского общественного благотворительного фонда		Учебно-методическое пособие Нимгирова А. С., Кульков В. Н., Набережная Ж. Б., Набережная И. Б. Организационно-теоретические аспекты экспертизы временной нетрудоспособности...
	Учебно-методическое пособие с элементами моделирования этических... Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов и интернов, курсантов факультетов повышения квалификации		Учебно-методическое пособие для выполнения самостоятельной курсовой работы Красноярск Г12 Экономика отрасли (Экономика дорожного строительства): учебно-методическое пособие [Текст] / сост. В. В. Гавриш, Е. В. Гуторин....