3.2. Определение микотоксинов (на примере патулина)
методом ВЭЖХ 3.2.1. Сущность метода
Для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов проводят пробоподготовку методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах «Диапак» (п. 3.2.3). Разделение, иден-тификацию и количественное определение микотоксинов в подготовленных пробах осущест-вляют методом высокоэффекти-вной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматог-рафе серии «Милихром–5» в модульном исполнении (рис. 12).
Рис. 12. Микроколоночный хроматограф
В работе рассматривается обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ для определения патулина. Детектирование проводят на длине волны 276 нм. Для точной идентификации патулина использу-ют также многоволновое детектирование, позволяющее применить в качестве дополнительного параметра идентификации спектральные отно-шения. Разделение осуществляют в режиме градиентного элюирования, что позволяет повысить разрешающую способность и чувствительность анализа.
3
2
Рис. 13. Жидкостный хроматограф:
1 – насос; 2 – узел ввода проб; 3 – хроматографическая колонка; 4 – детектор;
5 – слив для элюата или коллектор для фракций; 6 – регистратор (самописец,
интегратор или персональный компьютер)
5
6
4
1
Анализ пробы с помощью жидкостного хроматографа (рис. 13) осуществляется следующим образом. Определенный объем раствора анализируемой пробы с помощью узла ввода проб (2) вводится в верхнюю часть хроматографической колонки (3). С помощью насоса (1) анализируемая смесь прокачивается элюентом через хроматогра-фическую колонку (3), в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные фракции (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий разделенные компоненты, анализируется детектором (4), показания которого фиксируются регистратором (6).
Методические основы ВЭЖХ
Для понимания сущности метода ВЭЖХ, используемого для определения патулина, необходимо изучить некоторые методические аспекты, лежащие в его основе.
Элюотропные ряды. Элюирующей силой элюента называется способность элюента (растворителя или смеси растворителей) вытеснять адсорбат с поверхности адсорбента. При этом чем сильнее молекулы элюента адсорбируются на активных центрах сорбента, тем выше его элюирующая сила. Расположенные в ряд по возрастанию элюирующей силы растворители образуют элюотропный ряд [2].
В качестве элюентов для обращенно-фазовой хроматографии используются смеси растворителей, содержащие воду и органические соединения, модифицирующие элюирующую силу – н-спирты, ацетонитрил, тетрагидрофуран и другие, образующие с водой истинные растворы. В нормально-фазовой хроматографии в качестве элюентов используют полярные модификаторы – линейные и циклические углеводороды (гексан, циклогексан, гептан и др.).
Детекторы для жидкостных хроматографов. В настоящее время разработано более 20 детекторов для ВЭЖХ. Наибольшее распространение получили пять, три из которых являются оптическими, а два – электрохимическими. Эти пять детекторов позволяют анализировать все классы органических и неорганических веществ.
К оптическим детекторам относят спектрофотометрический детектор (ультрафиолетовый (УФ), работающий в волновом диапазоне
200–360 нм и видимый с волновым диапазоном 360–780 нм), флуориметрический и рефрактометрический детекторы; к электро-химическим – вольтамперометрический и кондуктометрический детекторы. Особое значение имеет масс-спектрометрический детектор, обладающий уникальной информативностью, так как позволяет проводить идентификацию хроматографически разделенных компо-нентов, используя базы данных масс-спектров веществ.
Спектрофотометрический детектор является наиболее распространенным детектором для ВЭЖХ. Принцип его действия основан на известном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера [5]. Спектро-фотометрический детектор регистрирует спектры избира-тельного абсорбционного поглощения излучения веществом. Спектры поглощения зависят от строения исследуемого вещества. Это позволяет идентифицировать вещество по его спектру, располагая библиотекой спектров или стандартами. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность полос спектров зависит от концентрации вещества, что является основой количественного анализа, т. е. определения концентра-ции вещества.
Пусть монохроматический свет от источника интенсивностью I0 попадает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С. Вещество способно поглощать монохроматическое излучение. Мерой способности поглощения данного монохроматического излучения служит величина ε – коэффициент молярного поглощения, или коэффициент экстинкции. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I. Согласно закону светопоглощения при длине волны λ=const
I=I0∙10-εCl , (7)
где I – интенсивность светового потока после прохождения кюветы;
I0 – интенсивность падающего светового потока; ε – коэффициент экстин-кции; С – молярная концентрация вещества в кювете; l – длина кюветы.
Отношение I к I0, выраженное в процентах, называется пропусканием Т, а величина А=lg(I0/I) – оптической плотностью.
A=lg(I0/I)= ε С∙l. (8)
Оптическая плотность вещества прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества. В спектрофотометрических детекторах аналитической величиной является оптическая плотность А. Формула (8) служит основой количественного анализа при использовании спектрофотометрического детектора, так как оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика.
Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм называется ультрафиолетовым спектром поглощения (рис. 14).
200 230 260 290 320 350 λ, нм
А, е.о.п.
Рис. 14. Ультрафиолетовый спектр поглощения водного раствора
вещества х
3.2.3. Пробоподготовка образцов
Любое вещество имеет длину волны максимального поглощения
(λ, нм). При использовании данной длины волны детектор имеет наименьший порог обнаружения вещества.
С помощью спектрофотометрического детектора (СФД) детектируется большое количество веществ различных классов, поглоща-ющих ультрафиолетовый свет.
Использование спектрофотометрического детектора в хроматогра-фии значительно облегчает идентификацию. Многоволновый детектор в сочетании с программным обеспечением позволяет получить хроматограмму на нескольких длинах волн одновременно и рассчитать дополнительный параметр для идентификации компонентов – спектральное отношение (Q) – отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн
 , (9)
где А1 и А2 – коэффициенты оптической плотности на длинах волн 1 и 2. Величина Q для каждого вещества является постоянной характеристикой и не зависит от его концентрации. Точность спектральных отношений зависит от значений оптической плотности вещества и конструкции детектора.
Пробоподготовка образцов при помощи метода твердофазной экстракции на концентрирующих патронах обеспечивает экономию временных и трудовых затрат. Твердофазная экстракция позволяет сконцентрировать пробу и очистить ее от сопутствующих примесей. Комплексная схема твердофазной экстракции предусматривает последовательное использование двух патронов:
– универсального концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» – патрона многоразового применения (до 50 проб) с набором верхних и нижних фильтров (10 шт.);
– универсального патрона для тонкой очистки «ДИАПАК С» – патрон одноразового применения.
Для подготовки концентрирующих патронов необходимо выполнить следующие операции.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З»:
– прокачать через патрон 10 мл смеси вода-ацетонитрил (58:42);
– непосредственно перед проведением пробоподготовки прокачать через патрон 10 мл дистиллированной воды.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК С»:
– прокачать через патрон 5 мл бензола и заглушить патрон с обоих концов.
Подготовка пищевого продукта к концентрированию
Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и коли-чественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. В колбу внести по 6,0 мл раствора Карреза I и раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем прозрачного фильтрата П.
При подготовке осветленных соков и напитков отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 мл прозрачного фильтрата П.
Концентрирование пробы на патроне «ДИАПАК П-З»
Весь объем фильтрата П нанести на предварительно подготовленный патрон со скоростью 1–2 капли в секунду.
Промыть патрон 5 мл бидистиллированной воды, отбрасывая все смывы.
Элюировать патулин с патрона 10 мл этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 мл
1,5%-ного водного раствора карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать расслоиться.
Собрать осушительную колонку, заполнив корпус с фильтром примерно 2 г безводного сульфата натрия, уплотнить осушитель постукиванием по стенке колонки и зафиксировать ватным тампоном.
Декантировать верхний этилацетатный слой при помощи пипетки, профильтровать через осушительную колонку, собирая фильтрат в отгонную сердцевидную колбу на 50 мл; дополнительно проэкстрагировать водный раствор карбоната натрия сначала 10 мл, а затем 5 мл этилацетата и, после расслоения, последовательно профильтровать декантированные объемы этилацетата через осушительную колонку в ту же колбу.
Упарить этилацетат в вакууме при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 мл (не упаривать досуха!), добавить 2,5 мл бензола (соблюдать соотношение объемов 1:5).
Очистка пробы на патроне «ДИАПАК С»
Снять заглушки с подготовленного патрона и пропустить бензол-этилацетатный раствор пробы со скоростью 1–2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5–1,0 мл смеси бензол-этилацетат (85:15) и нанести на патрон, отбросив смывы.
Элюировать патулин с патрона 6 мл смеси бензол:этилацетат (7:3), собирая элюат в сердцевинную отгонную колбу.
Упарить элюат досуха на суховоздушной бане при температуре не более 40°С.
Немедленно! После упаривания перерастворить пробу в 0,2–0,25 мл элюента А (п. 3.2.4.2), охлажденного до 5–8°С.
3.2.4. Порядок выполнения работы
Цель работы – определение содержания микотоксина патулина в составе пищевых продуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе серии «Милихром–5».
3.2.4.1. Методика измерений
Проведение измерений включает следующие основные этапы:
– градуировку хроматографа по растворам с известной массовой концентрацией патулина;
– подготовку пищевой пробы методом твердофазной экстракции по пп. 3.2.3;
– анализ экстракта методом ВЭЖХ с регистрацией сигнала УФ детектором;
– идентификацию патулина по параметрам удерживания и спектральным отношениям;
– вычисление массовой концентрации патулина в пробе на основе зарегистрированного аналитического сигнала (высоты пика) и градуировочного графика;
– вычисление массовой доли патулина в составе пищевого продукта.
Приборы, реактивы и материалы, необходимые для выполнения работы:
– хроматограф серии «Милихром–5» или любой другой хроматограф для ВЭЖХ с программным обеспечением WinXrom или Мультихром;
– хроматографическая колонка для ВЭЖХ: Диасфер–110–С10СN (5 мкм, 2×80 мм, ТУ 4215–001–05451931–94);
– дозатор переменного объема на 1–100 мкл;
– дозатор переменного объема на 100–1000 мкл;
– коническая колба с плотно притертым шлифом емкостью до 10 мл;
– мембранные фильтры;
– набор стандартных растворов патулина с концентрацией – 1, 2, 5 и 10 мг/л;
– фосфорная кислота 85%-ная;
– ацетонитрил для жидкостной хроматографии (о.с.ч. ТУ 6–09–3513–86, УФ поглощение до 200 нм);
– гексан, химически чистый (ректифицированный);
– трифторуксусная кислота;
– раствор Карреза I – 15,0 г гексацианоферата II калия растворить в 100 мл воды.
– раствор Карреза II – 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 мл воды;
– элюенты А, Б и С.
Приготовление элюентов
Элюент А. В мерную колбу с плотно притертым стеклянным шлифом емкостью 100 мл вносят 20 мл ацетонитрила и 0,5 мл 10%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Раствор тщательно перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой, предварительно отфильтрованной через мембранный капроновый фильтр (0,2 мкм). Затем проводят дегазацию элюента вакуумированием в течение 1 минуты при разрежении 1кг∙с/см2.
Элюенты Б и С готовят также как элюент А, только на 100 мл раствора берут 10 и 0 мл ацетонитрила, соответственно.
3.2.4.2. Установка хроматографических режимов разделения
и регистрации результатов
Для проведения измерений необходимо установить рабочие режимы хроматографа.
Режимы дозатора:
– регенерация – 300 мкл;
– объем пробы – 5 мкл;
– расход элюента – 150 мкл/мин;
– режимы градиентного элюирования: 800 мкл – элюента А,
500 мкл – элюента Б, 300 мкл – элюента С;
– температура термостата – 350С.
Режимы детектирования:
– число длин волн – 3;
– длины волн – 250, 276, 290 нм;
– время измерения – 0,04 с.
Кондиционирование хроматографической системы осуществляют за 30 минут до проведения измерений путем выполнения «холостого» анализа, в котором стандартную смесь, содержащую патулин, заменяют 5–10 мкл элюента, а затем проводят разделение стандартной смеси микотоксинов.
Задание 1. Изучить методику пробоподготовки пищевых продуктов для определения содержания патулина. Приготовить пробы в соответствии с п. 3.2.3.
Задание 2. Провести градуировку хроматографа. Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом стандартных растворов патулина с концентрациями 1, 2, 5 и 10 мг/л.
Под руководством преподавателя предлагается с клавиатуры ПК в программу (WinXrom) ввести параметры проведения хроматографического разделения (пп. 3.2.4.3) и запустить в автоматическом режиме 2–4 хроматографических анализа. Результаты оформить в виде табл. 6.
Т а б л и ц а 6
№ п/п
|
Удерживаемый объем (V), мкл
|
Высота пика, е.о.п.
|
Концентрация микотоксина в пробе, мг/л
|
1.
|
|
|
|
Хроматограмму стандарта необходимо сохранить в следующем формате: «СтандартДД–ММ–ГГ.001» (например, «Стандарт01–08–03.001»).
На основе полученных хроматографических профилей построить калибровочный график (по оси ординат откладывается концентрация – мг/л, по оси абсцисс оптическая плотность микотоксина А – е.о.п.).
Задание 3. Идентифицировать в исследуемом образце пищевого продукта патулин и определить его концентрацию.
Под руководством преподавателя запустить измерение подготовленной пробы пищевого продукта в автоматическом режиме
(с параметрами хроматографического разделения, выбранными в задании 2). По окончании измерения провести идентификацию микотоксина патулина по файлу стандарта («СтандартДД–ММ–ГГ.001»), полученному в задании 2. Используя калибровочный график, построенный в задании 2, определить концентрацию патулина в пробе пищевого продукта.
Результаты занести в табл. 7.
Т а б л и ц а 7
№ п/п
|
Наименование идентифицирован-ного микотоксина
|
Время удерживания,
(t), с или удерживаемый объем (V), мкл
|
Высота пика, е.о.п.
|
Концентрация (С) в экстракте пробы, мг/л
|
1.
|
|
|
|
|
Массовую концентрацию патулина в пробе пищевого продукта вычисляют по формуле
 , (10)
где С – массовая концентрация патулина в пробе, мг/л (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из значения высоты аналитического пика); Vp – объем пробы, мл; R – степень извлечения микотоксина на стадии пробоподготовки (равна 60%); Мпр – масса пробы пищевого продукта, использованной для очистки и последующего хроматографического определения, г.
Результат измерения массовой доли микотоксина в определяемом объекте представляют в следующем виде: Х ± мг/кг; при Р=0,95 и заносят в протокол (прил. 1), где Xi, – массовая концентрация патулина в пробе, мг/кг; Р – вероятность; – граница абсолютной погрешности, вычисляемая по формуле
 . (11)
После получения результата необходимо оценить значения нормативов оперативного контроля сходимости, которые приведены в соответствующих ГОСТах на методы контроля (анализа).
Сделать заключение о соответствии (или несоответствии) содержания патулина в исследованном пищевом продукте допустимым уровням, установленным СанПиН 2.3.2.1078–01.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие принципы лежат в основе классификации хроматографических методов анализа?
2. В чем сущность хроматографического разделения? Как проводят качественную идентификацию и количественный анализ?
3. В каких пищевых продуктах нормируется содержание микотоксинов? Какие микотоксины определяют в составе пищевых продуктов в соответствии с требованиями СанПиН?
4. Какой хроматографический метод используют для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов?
5. На чем основано спектрофотометрическое детектирование? Что такое спектральные отношения и для чего их используют?
6. Как проводят пробоподготовку пищевых продуктов для определения содержания патулина методом ВЭЖХ?
7. Проведение каких операций включает методика определения патулина методом ВЭЖХ?
8. Что такое элюент и градиентное элюирование? Какие элюенты используют при определении патулина методом ВЭЖХ?
9. Как проводят идентификацию патулина и его количественное определение?
10. Как обеспечивается точность определения патулина методом ВЭЖХ?
|
