РАБОТА 3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
ПРИ ОЦЕНКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ 3.1. Введение в область применения метода
Большинство пищевых продуктов имеют крайне сложный состав, обусловливающий многочисленные трудности при оценке их безопасности и качества. Анализ подобных систем начинают с выделения отдельных компонентов смеси, которое осложняется их малым содержанием. Для точного определения количества интересующего компонента используют специальную пробоподготовку: экстракцию, кристаллизацию, выпаривание, осаждение и т. д. Успешной альтернативой подобных методов пробоподготовки может быть процедура хроматографирования, т. е. разделения сложной смеси на составляющие компоненты.
Хроматография является гибридным аналитическим методом исследования, позволяющим не только разделить компоненты смеси, но и определить их качественный и количественный состав. В пищевой промышленности и санитарно-гигиенических исследованиях аналитика на 70–80% представлена хроматографическими методами.
Хроматография – физико-химический метод исследования веществ и их смесей, основанный на разделении компонентов в динамическом режиме за счет распределения их при перемещении между слоем неподвижной фазы и потоком подвижной фазы.
Подвижной фазой может быть либо газ – газовая хроматография (ГХ), либо жидкость – жидкостная хроматография (ЖХ). Жидкостная хроматография используется, когда анализируемые компоненты смеси термолабильны, нелетучи, имеют молекулярную массу более 1000 а.е.м. В остальных случаях используют ГХ.
Неподвижной фазой является пористое или гранулированное вещество или тонкая пленка жидкости, адсорбированная на твердой поверхности носителя. В зависимости от вида геометрии слоя неподвижной фазы хроматографию подразделяют на колоночную или плоскослойную. К последней относят бумажную (БХ) и тонкослойную хроматографию (ТСХ). Методы БХ и ТСХ изучались в дисциплине «Физико-химические методы контроля качества товаров» [4]. Предметом данной работы является знакомство с различными вариантами колоночной хроматографии – жидкостной и газожидкостной хроматографией – и их возможностями для оценки безопасности пищевых продуктов.
В колоночной хроматографии распространена классификация, основанная на относительной полярности подвижной и неподвижной фаз. Разнообразные механизмы взаимодействия сорбатов с неподвижной фазой служат основой для классификации вариантов жидкостной хроматографии. Различают нормально- и обращено-фазовую хрома-тографию. В первом случае неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, и основным механизмом, определяющим удерживание, служит взаимодействие сорбатов непосредственно с активными центрами сорбента за счет образования водородных связей. Во втором – наоборот подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента [2, 7, 9].
Основным элементом системы для газовой (ГХ) и жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является хроматографическая колонка, представляющая собой калиброванную трубку, заполненную пористым сорбентом, через которую непрерывно пропускается (с определенной скоростью) элюент – гомогенная смесь растворителей (ВЭЖХ) или газ-носитель (ГХ). Сорбент (наполнитель колонки) удерживается в колонке с двух сторон микропористыми (металлическими) фильтрами и в процессе разделения остается неподвижным. В его объеме происходит разделение смеси веществ (сорбатов) на отдельные фракции. Сорбент обеспечивает разделение молекул, если обладает хотя бы одним из приведенных ниже основных свойств: 1) физически адсорбирует растворенные вещества из раствора; 2) химически взаимодействует с веществами раствора; 3) растворяет разделяемые вещества в несмешивающемся растворителе при контакте с растворами; 4) имеет пористую структуру и поэтому удерживает одни растворенные вещества и не задерживает другие в зависимости от их размера или формы.
После введения в верхнюю часть колонки аликвотной части анализируемой смеси различных сорбатов начинается их перемещение вдоль колонки. В процессе движения молекулы сорбатов взаимодействуют с активными центрами поверхности неподвижной фазы. Время, в течение которого молекулы находятся в адсорбированном состоянии, определяется силой межмолекулярного взаимодействия сорбатов с сорбентом. При очень слабом взаимодействии молекулы (А) почти все время находятся в растворе подвижной фазы и поэтому перемещаются вниз по колонке со скоростью, лишь незначительно отличающейся от скорости движения подвижной фазы. Напротив, при очень сильной адсорбции молекулы (В) с трудом отрываются от поверхности, и скорость их перемещения вдоль слоя адсорбента незначительна (рис. 9).
Хроматограмма является графическим результатом хроматографического процесса, кривой, описывающей зависимость изменения концентрации анализируемых веществ в элюате1 от времени (объема). С точки зрения аппаратурного оформления хроматограммой можно назвать зависимость отклика детектора хроматографа от времени (объема) прохождения элюата через ячейку детектора.
Рис. 9. Хроматографическое разделение:
а – гипотетическое разделение двух разных молекул А и В. Линия правее колонки изображает распределение молекул двух видов по высоте слоя; б – размывание зон при разделении реальной пробы вследствие отклонения величины скорости перемещения отдельных молекул
от средней скорости для данного вида молекул
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
В
В
В
В
А
А
А
А
В
А
В
А
В
В
В
В
В
А
А
А
А
В
А
В
А
В
В
В
В
В
А
А
А
А
В
б
а
Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых в идеальном случае (при полном разделении фракций) соответствует одному компоненту анализируемой пробы (рис. 10). Площадь (высота) пика пропорциональна концентрации компонента в элюате. Пик – кривая, в идеале приближающаяся к кривой распределения Гаусса, описывает постепенное нарастание концентрации вещества на выходе из колонки и последующее ее уменьшение.
При описании хроматографических процессов используют следующие понятия.
Время удерживания вещества (tR) – время пребывания исследуемого вещества в хроматографической колонке (время появления максимума пика на хроматографическом профиле рис. 10). Для любого вещества при одинаковых условиях хроматографического разделения, использовании одной и той же колонки и минимальных колебаниях температуры окружающей среды время удерживания является специфичной и индивидуальной характеристикой. На этом основана идентификация компонентов разделяемой смеси.
t0
t'R1
tR1
t'R2
tR2
Рис. 10. Хроматограмма:
tRi – времена удерживания хроматографических пиков (удерживаемые объемы),
t'Ri – исправленные времена удерживания, t0 – время элюирования несорбируемого вещества
Время удерживания несорбируемого вещества (t0) – время элюирования вещества, которое не удерживается слоем адсорбента. Величина t0 является важной характеристикой данной хроматографической системы при постоянном расходе элюента.
Исправленное время удерживания (t'R) рассчитывается по формуле
t'R= tR–t0. (3)
Удерживаемый объем (VR) компонента – объем элюента, прошедшего через колонку к моменту выхода элюационного максимума пика, определяется по формуле
VR= tR∙w, (4)
где w – объемная скорость подачи элюента, мкл/мин или мл/мин.
Объем удерживания несорбируемого компонента (V0) равен «мертвому» объему хроматографической системы.
Исправленный удерживаемый объем (V'R) определяется по формуле
V'R= VR–V0=w∙tR–w∙t0= w∙t'R . (5)
Коэффициент емкости (К') характеризует степень удерживания вещества в данной хроматографической системе и рассчитывается по формуле
 . (6)
Этот параметр не зависит от размеров колонки.
Сигнал
Шум
Рис. 11. Соотношение сигнал-шум при определении предела детектирования
Пределом детектирования называется количество вещества, введенного непосредственно в кювету детектора, при котором сигнал детектора в два раза превышает его шум (рис. 11).
Качественный хроматографический анализ
Для идентификации веществ на полученной хроматограмме исследователю необходимо установить:
какому веществу соответствует отдельный пик на хроматограмме анализируемой смеси;
какому пику на хроматограмме соответствует искомое анализируемое вещество.
Наиболее надежные результаты идентификации получают, если исследователь располагает химически чистыми веществами – стандартами, присутствие которых предполагается в анализируемой смеси. Растворы стандартов определенной концентрации называют стандартными растворами.
Идентификацию с использованием стандартных растворов проводят следующим образом:
1) подбирают оптимальные условия разделения анализируемой смеси;
2) измеряют параметры удерживания всех хроматографических пиков анализируемой смеси и смеси стандартов.
Если в анализируемой смеси находится хроматографический пик с параметрами удерживания, близкими к стандарту, то возможны следующие варианты:
1) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение. В этом случае идентификация закончена;
2) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение, но хроматографический пик компонента анализируемой смеси является неразделенным с хроматографическим пиком другого соединения. В этом случае необходимо изменить хроматографические условия и разделить плохо разделившиеся пики;
3) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси являются разными веществами, так как несмотря на совпадение параметров удерживания, различаются по дополнительным характеристикам идентифи-кации (например, имеют разные спектральные отношения – см. п. 3.2.2).
Количественный хроматографический анализ
В количественном анализе используют методы внутреннего и внешнего стандартов.
При использовании метода внутреннего стандарта (относительного метода) в анализируемую смесь добавляют компонент А известной концентрации с коэффициентом удерживания К', отличным от коэффициентов удерживания анализируемых веществ смеси. Это позволяет решать следующие задачи: оценивать воспроизводимость и достоверность анализа, определять изменение концентраций веществ смеси относительно компонента А и др.
На практике часто необходимо знать абсолютную концентрацию каждого компонента смеси. В таких случаях используют метод внешнего стандарта (абсолютной калибровки), который предусматривает следующую последовательность проведения анализа.
Сначала производят градуировку хроматографа по стандартным растворам определяемых соединений, т. е. строят зависимость кон-центрации искомого соединения от высоты (площади) его хроматографического пика. Градуировку осуществляют таким образом, чтобы ожидаемый диапазон концентраций анализируемого соединения в исследуемой смеси находился в пределах градуировочной кривой.
Затем на хроматографическом профиле анализируемой смеси находят высоту (площадь) хроматографического пика определяемого соединения и по градировочному графику рассчитывают его концентрацию.
|
