Методические рекомендации Содержание
Скачать 0.98 Mb.
|
5.2 Сравнительные характеристики методов оценки CDT и обоснование целесообразности использования метода капиллярного электрофореза для проведения диагностических исследований на хроническое злоупотребление алкоголем К настоящему времени разработан широкий спектр методов определения уровня CDT, среди которых практическое применение нашли методы непрямой и прямой иммунонефелометрии [37, 73, 80, 112], высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [37, 67, 68, 69, 74, 76, 81, 107, 121] и капиллярный электрофорез [48, 51, 52, 76, 90, 91, 98, 106, 109]. Сравнительная оценка, обзор литературных источников, анализ текущих положений и рекомендаций международной рабочей группы IFCC по стандартизации CDT показали, что, несмотря на относительную экономичность, иммунологические методы не являются приемлемыми для реализации диагностического механизма, взятого за основу в настоящих методических рекомендациях, т.к. обладают рядом существенных ограничений. Основным из них является несоответствие оцениваемого иммунологическими методами аналита текущему (до завершения международной стандартизации CDT) и/или новому определению CDT, выдвинутого рабочей группой IFCC по стандартизации CDT в 2007 г. Так, методы непрямой иммунонефелометрии не позволяют полностью разделить низкосиалированные изоформы от высокосиалированных изоформ трансферрина, в т.ч. от трисиалотрансферрина, что противоречит текущему определению аналита, негативным образом отражается на аналитической специфичности маркера и повышает риск ложноположительных результатов [41, 43, 45, 59, 72, 80]. Метод прямой нефелометрии, представленный коммерческим тестом N Latex CDT производства [11, 17, 71, 88], использует антитела, направленные к углевод-дефицитным изоформам трансферрина (асиало, моносиало-, дисиало-), но не позволяющие изолированно детектировать изоформу дисиалотрансферрина [11, 53], что вносит существенные ограничения к использованию данного метода в рамках грядущей международной стандартизации CDT, в соответствии с которой первичным аналитом CDT будет утвержден дисиалотрансферрин [80, 84]. Более того, иммунологические методы требуют дополнительного измерения общей концентрации трансферрина для выражения результатов в рекомендованных IFCC единицах измерения %CDT, предоставляют результат в виде числового значения, что не позволяют визуализировать возможные факторы интерференции (генетические варианты трансферрина и пр.) и требуют обязательного подтверждения результатов при помощи разделительных методов [40, 42, 53, 66, 72, 76, 80, 86, 110, 114, 115, 124] . В связи с неэффективностью такого подхода иммунологические методы были исключены из диагностического механизма оценки CDT. Разделительные методы – ВЭЖХ и капиллярный электрофорез – лишены недостатков иммунологических методов, позволяя детектировать, проводить визуальную и количественную оценку изоформ CDT как суммарно по всем углевод-дефицитным фракциям, так и изолированно по дисиалотрансферрину [67, 68, 74, 76, 81, 91, 121, 127]. В дополнение к этому разделительные методы позволяют выявлять возможные генетические варианты трансферрина, тем самым сводя к минимуму риск ложной трактовки результатов исследования [43, 52, 67, 69, 72, 79, 94, 98, 124]. Сравнительный анализ коммерческих производителей анализаторов и тест-систем определения CDT разделительными методами показал, что доступные российскому пользователю и разрешенные для диагностики in vitro ВЭЖХ системы не удовлетворяют критериям отбора в части технических характеристик. Основными ограничениями ВЭЖХ анализаторов являются длительная пробоподготовка, обусловливающая продолжительность исследования 1 образца свыше 60 минут, что делает метод непригодным для задач скрининга, а также необходимость индивидуальных пользовательских настроек и адаптаций в случае использования ВЭЖХ анализаторов различных производителей, что негативным образом отражается на такой характеристике, как воспроизводимость результатов и повышает межлабораторную вариабельность [30, 67, 74]. Наиболее приемлемыми с практической точки зрения являются анализаторы CDT методом капиллярного электрофореза. В настоящее время оценка CDT возможна при помощи коммерческих анализаторов трех производителей: Beckman Coulter (системы P/ACE 5000 и P/ACE MDQ) [15, 16, 20], Sebia (системы Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing) [10, 12, 13, 14, 51, 76, 98, 106, 109], Helena Bioscience (система V8) [9, 18, 19]. Исходя из данных Государственного реестра медицинских изделий и организаций, осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий, размещенных в открытом доступе сети интернет на сайте Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения по состоянию на 30 декабря 2013 г. системы капиллярного электрофореза производства Beckman Coulter не зарегистрированы и, таким образом, не могут использоваться в целях in vitro диагностики на территории РФ. Системы капиллярного электрофореза Sebia и Helena Bioscience, а также расходные материалы к ним зарегистрированы и потому были допущены к оценке по вышеприведенным критериям. Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализатора V8 производства Helena Bioscience, показала, что метод имеет ограничения по измерению такой углевод-дефицитной фракции, как асиалотрансферрин [9, 18, 19], что вызывает затруднения с последующей гармонизацией метода с международной системой стандартизации CDT, т.к. асиалотрансферрин рассматривается IFCC в качестве перспективного вторичного аналита [39, 80, 83]. Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении системы V8 производства Helena Bioscience не был включен ни в одно из опубликованных и/или находящихся в печати многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследований, проведенных в период с 2007 по 2013 гг. Более того, в последней публикации "Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: III. Performance of native serum and serum spiked with disialotransferrin proves that harmonization of CDT assays is possible», размещенной от имени рабочей группы IFCC по стандартизации CDT в 2013 г. в журнале Clinical Chemistry, равно как и в предыдущих публикациях рабочей группы, метод капиллярного электрофореза Helena Bioscience не фигурирует [80, 84]. В полученных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма отзывы о методе капиллярного электрофореза Helena Bioscience также отсутствуют. Пилотных проектов по оценке аналитических характеристик и диагностической ценности метода Helena Bioscience в России на момент подготовки настоящих Методических рекомендаций выявить не удалось. Очевидным недостатком анализатора V8 является также его высокая рыночная стоимость и ограниченное меню тестов (анализатор не позволяет проводить оценку маркера сахарного диабета) [9, 18, 19]. Таким образом, отсутствие доказательной базы и ограниченные функциональные характеристики не позволяют рекомендовать анализатор V8 производства Helena Bioscience для практического использования в диагностических программах по выявлению хронического злоупотребления алкоголем на территории Российской Федерации. Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализаторов Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing производства Sebia, показала отсутствие ограничений как в отношении критериев, относящихся к системе международной стандартизации CDT, так и в отношении технических характеристик приборов. Метод Sebia позволяет разделять, визуализировать и проводить суммарную или пофракционную количественную оценку всех углевод-дефицитных фракций. Такой подход позволяет использовать данный метод в полном соответствии с текущим и рекомендованным определением аналита. Оценка результатов CDT проводится в относительных единицах (% CDT), что также соответствует выдвинутым рекомендациям IFCC и позволяет избежать интерференции со стороны колебаний общей концентрации трансферрина [10, 12, 13, 14, 51, 66, 79, 80, 86, 98, 106, 109, 110, 114, 124]. Технические характеристики метода капиллярного электрофореза Sebia также полностью соответствуют выдвинутым критериям оценки [98, 106, 109]. Оба анализатора обеспечивают полную автоматизацию исследования, включая пробоподготовку; обеспечивают полную прослеживаемость образца от момента взятия пробы до выдачи результата исследования (работа с первичной штрих-кодированной пробиркой), позволяют проводить визуальную оценку генетических вариантов трансферрина [10, 12, 13, 14, 79, 94, 98] и выявлять состояния, при которых применение маркера CDT должно быть ограничено (2-3-сиало блок) [10, 12, 65] или требуется специальная подготовка образца для снятия возможной интерференции со стороны иммуноглобулинов [48]. Время исследования одного образца, включая этап пробоподготовки, не превышает 13-15 минут, наличие двух анализаторов средней (Minicap) и высокой (Capillarys 2 Flex Piercing) производительности позволяет оптимизировать рабочие потоки в зависимости от условий конкретной лаборатории и масштабов скрининга. Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении систем капиллярного электрофореза Sebia имеет положительный опыт участия в крупнейших многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследованиях, включая публикации рабочей группы IFCC по стандартизации CDT, где подтверждаются высокие аналитические характеристики данной технологии [84, 98, 106, 109]. Немаловажным преимуществом является участие систем Sebia в крупном эпидемиологическом исследовании на российской выборке [1, 97], пилотное трехлетнее испытание систем на базе Московского научно-практического центра наркологии, а также положительный опыт использования анализаторов Minicap на базе наркологических диспансеров Новосибирска, Краснодара, Казани, Чеченской Республики. В предоставленных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма были получены положительные отзывы о методе капиллярного электрофореза Sebia. Уникальным преимуществом рассмотренных анализаторов Sebia является возможность сочетания в одном приборе нескольких диагностически значимых скрининговых тестов, таких как оценка белковых фракций с возможностью выявления профилей хронического поражения печени и определение гликированного гемоглобина – ключевого маркера при диагностике и мониторинге сахарного диабета [35, 56]. Мультифункциональность данного метода позволяет оптимизировать экономические затраты на оборудование и расширить диагностическую панель, в т.ч. по таким социально-значимым и нередко алкоголь-ассоциированным нозологиям, как сахарный диабет [3, 32, 60, 118, 123] и болезни гепатобилиарной системы [27, 34, 36]. Таким образом, для достижения наибольшей диагностической эффективности, минимизации рисков неспецифического ответа и оптимизации экономической составляющей процедуры обследования рекомендовано использование систем капиллярного электрофореза Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing производства Sebia. 5.3 Описание метода капиллярного электрофореза и технологии определения карбогидрат-дефицитного трансферрина Согласно вышеописанным критериям в качестве метода, наиболее подходящего для рутинных скрининговых исследований, был выбран метод капиллярного электрофореза в исполнении автоматических капиллярных систем Minicap или Capillarys производства Sebia и наборов реагентов к ним. Данный метод основан на разделении заряженных молекул в жидкой среде внутри сверхтонкого кварцевого капилляра под действием электрического тока. Белковые молекулы при этом разделяются согласно своему электрическому заряду. На разделение также оказывают влияние рН электролита и электроэндоосмотический поток. Метод не требует предварительной обработки образцов и позволяет осуществлять как качественную, так и количественную оценку фракций трансферрина. Расчетная формула CDT полностью соответствует текущему определению аналита (суммарное значение углевод-дефицитных фракций трансферрина), и одновременно с этим программное обеспечение прибора дает возможность производить количественную оценку каждой карбогидрат-дефицитной фракции в отдельности, что позволит использовать данные системы после утверждения международных рекомендаций по стандартизации CDT без каких-либо ограничений [13, 14]. Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты. Аналитический этап на системах Capillarys/ Minicap полностью автоматизирован и включает в себя разведение образца и его инъекцию в анодную часть капилляра. Под действием высокого напряжения образец, мигрируя по всей длине капилляра, разделяется на фракции, каждая из которых, достигая катодной части капилляра, последовательно регистрируется путем измерения поглощения пептидных связей, определяемого при 200 нм. Детекция изоформ трансферрина осуществляется в следующем порядке: асиало-, дисиало-, трисиало-, тетрасиало- и пентасиалотрансферрин. После завершения миграции капилляры немедленно промываются моющим раствором и подготавливаются к разделению следующего образца, заполняясь буфером для электрофореза [10, 12]. После детекции результаты обрабатываются программным обеспечением прибора и отображаются на экране монитора в виде процентного содержания фракций (количественный анализ) и денситометрической кривой (качественный анализ) (Приложение 5, Пример 1). Результаты качественной и количественной оценки импортируются в протокол исследования, служащий приложением к заключению о результатах анализа (Приложение 6). 5.4 Оборудование и тест-системы для капиллярного электрофореза Sebia В качестве систем для определения карбогидрат-дефицитного трансферрина могут использоваться оба варианта анализаторов капиллярного электрофореза - Minicap или Capillarys и наборы реагентов к ним (Приложение 3). Оба анализатора идентичны по принципу действия и отличаются только своей пропускной способностью [13, 14]. Система Capillarys имеет 8 встроенных капилляров, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 8 анализов по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Capillarys составляет 38 образцов в час, благодаря чему она может быть рекомендована для оснащения крупных скрининговых центров, выполняющих от 50-100 анализов CDT в день. Система Minicap имеет 2 встроенных капилляра, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 2 анализа по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Minicap составляет 10 образцов в час, что оптимально для лабораторий со средним потоком CDT исследований – 20-50 тестов в день. Перечень реагентов и расходных материалов для определения маркера CDT на приборах Capillarys и Minicap приведен в Приложении 3. Системы Capillarys/ Minicap обеспечивают полную автоматизацию аналитического этапа, высокую пропускную способность, возможность проведения анализа из первичной пробирки и использование функции считывания штрих-кода. Программное обеспечение систем полностью русифицировано и позволяет хранить и обрабатывать большие массивы данных. Аналитические характеристики метода Sebia подтверждены в испытаниях на статистически достоверной выборке российской популяции, проведенных в ГУЗ МНПЦ в период с 2011 по 2012 гг., а также в крупном популяционном исследовании российской выборки в рамках международного исследования, опубликованного в статье “Comparative performance of biomarkers of alcohol consumption in a population sample of working-aged men in Russia: the Izhevsk Family Study” группой авторов из Лондонской школы гигиены и тропической медицины Лондонского Университета, Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Ижевской государственной медицинской академии, Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и Департамента лабораторной медицины Каролинского института [1, 97]. Системы капиллярного электрофореза Capillarys/ Minicap, наборы реагентов и расходные материалы к ним зарегистрированы как изделия медицинского назначения и разрешены к использованию для in vitro диагностики на территории Российской Федерации. |
Похожие:
 | Целью выполнения курсовой работы является необходимость закрепления всех знаний и практических навыков, полученных в результате изучения... | | Примерный макет коллективного договора (Методические рекомендации) |
 | Методические рекомендации определяют цели и задачи, конкретное содержание, особенности организации и порядок прохождения производственной... | | Пояснительная записка |
| Го аудита (далее – Методические рекомендации) разработаны в соответствии с требованиями Бюджетного кодекса Российской Федерации и... | | ... |
| Методические рекомендации предназначены для студентов всех форм обучения по специальности 030501 «Юриспруденция» исодержат рекомендации... | | Методические рекомендации предназначены для студентов всех форм обучения по специальности 030501 «Юриспруденция» исодержат рекомендации... |
| Основное содержание и формы проведения государственной итоговой аттестации студентов-выпускников вуза | | Основное содержание и формы проведения государственной итоговой аттестации студентов-выпускников вуза |