Генотипирование генетически модифицированных животных с помощью метода пцр учебно-методическое пособие
Скачать 232.39 Kb.
|
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Национальный исследовательский университет ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов, магистров и аспирантов ННГУ, обучающихся по специальности 020400 «Биология», профили «Биофизика», «Нейродинамика и нейробиология» Нижний Новгород 2014 УДК 57.085.19(075.8) ББК Е 0.с11(я73-4) М 54 М 54 ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР. Авторы: Тюрикова О.В., Дембицкая Ю.В., Доронин М.С., Лебедева А.В., Бабаев А.А., Семьянов А.В.: Учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2014. – 21 с. Рецензент: д.м.н. Н.А. Добротина Учебное - методическое пособие содержит краткие теоретические и практические сведения по методике проведения полимеразной цепной реакции с целью генотипирования генетически модифицированных животных. Руководство предназначено для студентов, магистров и аспирантов ННГУ, обучающихся по специальности 020400 «Биология», в рамках курса «Экспериментальные методы клеточной нейробиологии». Ответственный за выпуск: председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ, д.п.н., профессор И.М. Швец УДК 57.085.19(075.8) ББК Е0.с11(я73-4) © Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского, 2014 © Тюрикова О.В., Дембицкая Ю.В., Доронин М.С., Лебедева А.В., Бабаев А.А., Семьянов А.В., 2014 ОГЛАВЛЕНИЕОГЛАВЛЕНИЕ 4 Введение 4 1.1. Линия мышей с экспрессией белка GCaMP2 в астроцитах 7 1.2. Линия мышей Clomeleon, экспрессирующая YFP и CFP белки в нейронах 9 2.1. Процедура получения биологического материала 11 2.2. Выделение ДНК и подготовка реактивной смеси для ПЦР 12 2.3. Составление программы для ПЦР - амплификатора 13 2.4. Проведение электрофореза 14 2.4.1. Подбор необходимого материала 14 2.4.2. Подбор уровня напряжения 14 2.4.3. Подбор буфера 15 2.5. Протокол электрофореза для линии мышей GCaMP2 15 Лабораторная работа №1«Приготовление TBE буфера» 17 Лабораторная работа №2 19 «Приготовление агарозного брикета и заполнение его ячеек» 19 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 21 ВведениеГенная инженерия появилась в результате работ в областях биохимии и молекулярной генетики. В биологии долгое время главным классом макромолекул считались белки, также предполагалось, что гены имеют белковую природу. В 1944 году Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty показали роль ДНК в хранении и передаче генетической информации. С этого времени началось интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году James Watson и Francis Crick открыли структуру двуспиральной ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии. Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование. Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности. Третий этап – начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете Paul Berg, Stanley Cohen, Herbert Boyer с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli. В 1980 году за эту новаторскую работу была получена Нобелевская премия по химии и премия Ласкера. Сегодня же учёные способны рекомбинировать, трансформировать, редактировать и программировать генетический материал. Гены животных и человека могут добавляться растениям или животным, порождая новейшие трансгенные жизненные формы. Биоинженеры по всему миру могут создавать десятки тысяч новых организмов в течение нескольких лет. Например, японские ученые в своих экспериментах с генами вывели новый вид крыс, которые чирикают как птицы (http://news.discovery.com/animals/zoo-animals/mouse-tweets-genetic-modification-101221). Также генная инженерия широко применяется в пищевой промышленности. Так, например, для повышения морозоустойчивости у томатов и клубники «вживляется» ген северных рыб, для предотвращения пожирания вредителями кукурузы или картофеля «прививаются» гены яда змеи или смертельных бактерий для колорадского жука (Lemaux, 2008). Генная инженерия играет существенную роль в лабораторных исследованиях. Всё большее применение приобретают генетически модифицированные животные для решения научных задач. Для многих нейрофизиологических исследований используются флуоресцентные методики для визуализации различных видов клеток или визуализации динамики ионных токов, например, в астроцитах или нейронах. Также часто необходимо идентифицировать определённые типы клеток в определённой области. Для таких целей, например, генетически модифицированные мыши с кальциевым индикатором – комплексом белков GCaMP. Кроме того, для получения экспериментальных животных, в геноме которых отсутствует определённый ген, используется генно-инженерный метод нокаута генов (gene knock-out). Основной целью генетического нокаута является выяснение физиологической и патофизиологической роли тех или иных генов иммунной системы. Важно отметить, что при создании новых линий животных с использованием генной инженерии обязательно проводятся иммуногистохимические и поведенческие исследования для изучения влияния генетической модификации на жизнеспособность и другие функции особей животных. Глава 1. Использование генетически модифицированных животных в нейрофизиологических экспериментах1.1. Линия мышей с экспрессией белка GCaMP2 в астроцитах GCaMP2 – это генетически закодированный кальциевый индикатор, являющийся комплексом, состоящим из зеленого флуоресцентного белка GFP, кальций - связывающего белка кальмодулина и белка M 13 (Рисунок 1, рис. 2 Б).  Рисунок 1. Модифицированный участок белка GCaMP2 (Akerboom и др., 2009) GFP состоит из 238 аминокислотных остатков (26,9 кДа) (Рисунок 2 А) и впервые был найден у медузы Aequorea Victoria.  Рисунок 2. Структура GFP и GCaMP2. А – структура GFP и хромофорной группы адсорбирующей свет (http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/fpintroduction.html); Б – структура GCaMP2 (Akerboom и др., 2009) GFP имеет максимум поглощения в области спектра 395-475 нм, а в спектре эмиссии в области – 509 нм (). Однако сейчас создано много модификаций GFP, имеющих различные оптические свойства, что позволяет широко применять GFP как эффективный генетически закодированный индикатор.  Рисунок 3. Спектр поглощения и эмиссии GFP (http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/fpintroduction.html) Существенным достоинством GFP является отсутствие токсичности, присущей химическим красителям, стабильность концентрации, фотостабильность, неинвазивность и возможность локальной окраски. Локальность окрашивания зависит от регуляторной последовательности участка ДНК, в который внедряется ген кодирующий GFP. Таким образом, можно закодировать экспрессию GFP в специфичных типах клеток или клеточных органеллах. Кальмодулин способен связывать кальций, поэтому при наличии кальция в цитоплазме связывание GFP с кальмодулином обуславливает флуоресценцию GCaMP2. Белок М 13 способствует усилению сигнала GFP, поскольку кальмодулин наматывается вокруг белка М 13. Это позволяет значительно улучшить соотношение сигнал/шум. Это особенно критично, т.к. кальций присутствует в клетке очень короткое время. Особый интерес представляет изучение кальциевой активности в астроцитах. Они имеют тонкие отростки и химические красители не дают достаточного разрешения, поэтому астроцит-специфичная экспрессия GCaMP2 необходима для таких экспериментов. Специфичность к астроцитам достигается за счет скрещивания двух линий мышей, несущих гены tetO-GCaMP2 (кальциевый индикатор) и GLT-1-tTA (ген, специфичный для глутаматных транспортеров астроцитов). Мыши, несущие оба гена, имеют экспрессию GCaMP2 только в астроцитах ( А). Это позволяет проводить детекцию флуоресценции GCaMP2 в астроцитарных отростках ( Б) необходимую для расчёта частоты кальциевых событий на целой клетке ( В).  Рисунок 4. Эксперессия GCaMP2 в астроцитах. А – астроцит, экспрессирующий GCaMP2; Б – детекция флуоресценции GCaMP2 в астроцитарных отростках для расчёта частоты кальциевых событий на целой клетке; В – частота кальциевых событий на всей клетке 1.2. Линия мышей Clomeleon, экспрессирующая YFP и CFP белки в нейронах Clomeleon (CLM1) – это линия мышей B6Cg-Tg (Thy1-CFP, YFP) CLM1 Gjau/J, созданная в лаборатории George J. Augustine, Duke University Medical Center. Мыши данной линии экспрессируют два флуоресцентных белка CFP (голубой флуоресцентный белок) и YFP (жёлтый флуоресцентный белок), работающих как рациометрические индикаторы для ионов Cl-, закодированных под промотером Thy1.2 (Thy1, thymuscellantigen 1, theta, promoter) (Berglund и др., 2006) (рис.5). CLM1 обладает высоким уровнем экспрессии в митральных клетках, нейронах обонятельной луковицы, кортикальных нейронах пятого слоя, зубчатой фасции гиппокампа (рис. 6 А), пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа (рис. 6 Б), в миндалине, гранулярных клетках мозжечках и в клетках ретины. При низкой концентрации ионов Cl- YFP флуоресцирует по принципу флуоресцентной резонансной передачи энергии (FRET), принимая энергию от флуоресценции CFP.   Рисунок 5. Встраивание в комплементарную ДНК CFP и YFP , связанных участком из 24 аминокислотных остатков (отмечено серым) (Berglund и др., 2006) Когда концентрация ионов Cl- вырастает, флуоресценция YFP снижается, а флуоресценция CFP возрастет. С использованием калибровочной кривой соотношение флуоресценции YFP/CFP отражает концентрацию ионов Cl-. Мыши CLM1 являются гомозиготными по встраиваемому гену, жизнеспособными, они сохраняют репродуктивную способность, не имеют поведенческих отклонений или отклонений в развитии (http://jaxmice.jax.org/strain/013161.html). Трансген YFP/CFP инъецировался в оплодотворенные яйцеклетки под промотером Thy1.2, затем проводилось обратное скрещивание потомства с мышами линии C57BL/6 более чем для 6 поколений с целью образования колонии CLM1. Высокий уровень экспрессии CLM1 позволяет проводить морфометрические измерения, например размера дендритных шипиков (рис. 6 В).  Рисунок 6. Экспрессия CLM1 в гиппокампе. А – зубчатая фасция; Б - пирамидные нейроны поля СА 1 гиппокампа (Berglund и др., 2006); В – измерение размера дендритных шипиков в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа Глава 2. Протокол для генотипирования генетически модифицированных животныхОбычно вместе с генно-модифицированными животными поступает вся необходимая информация по их скрещиванию и генотипированию. Также всю необходимую информацию для подбора оптимальных протоколов можно найти на сайтах поставщиков данных линий животных. Например, на сайте The Jacksons Laboratory можно найти не только протокол для той или иной линии животных, но и найти часто встречающиеся ошибки, происходящие при генотипировании (http://jaxmice.jax.org/support/genotyping/). 2.1. Процедура получения биологического материала Генотипирование проводят, когда животные достигают возраста двух-трёх недель. Для генотипирования мышей необходимо получить биологический материал, содержащий ДНК для его дальнейшего исследования. Чаще всего используется кончик хвоста примерно 0,5 см или небольшой кусочек уха. При получении биологического материала следует пометить каждую особь отличительной чертой, кроме того следует оставить комментарии непосредственно на этикетке клетки.  Рисунок 7. Способы идентификации животных. А – окраска меха с помощью не токсичных чернил; Б – окрашивание хвостов с помощью не токсичных чернил; В – ушные бирки; Г – процедура прокола уха; Д – прокол уха (http://www.theodora.com/rodent_laboratory.html) Существует большое количество вариантов как именно можно пометить особь. Важно выбрать тип идентификации исходя из сроков проекта, количества признаков необходимых выявить и возраста особи. Перманентные отличия достигаются с помощью окраски хвоста, ушей или меха животного нетоксичными чернилами (рис. 7 А, 7 Б). Более долговременным методом является осуществление проколов, надрезов на ушах (рис. 7 Д) и использование ушных бирок (рис. 7 В). Биологический материал, полученный от каждой особи помещается в отдельную пробирку, с присвоением определенного номера (оптимальный объем пробирки 1.5 мл). Соответствие номеров пробирок и отличительных черт мышей отражается в журнале лабораторных исследований. 2.2. Выделение ДНК и подготовка реактивной смеси для ПЦР Для разрушения клеточных мембран и ядер в каждую пробирку добавляют 400 мкл специального буфера TBS (Tail Solubilization Buffer) имеющим состав (мМ): 100 ТРИС, 5 ЭДТА, 200 NaCl и 8 мкл протеиназы К. Затем пробирки помещают в инкубатор при температуре 60°С на период не менее 5 часов. Также существует вариант выделения ДНК с использованием хлороформа. Для этого после инкубации в каждую пробирку добавляют хлороформ объемом эквивалентному объему TBS, а также 100 мкл 5мМ ацетата калия. После этого содержимое перемешивается с помощью вихревой или ультразвуковой мешалки и инкубируется в течение 10 минут на льду. После инкубации в течение 15 минут пробирку с содержимым центрифугируют при 13000 оборотах при температуре 4° С. После перемещения супернатанта в новую пробирку в неё же добавляют 1 мл 100 %-ного этанола и снова центрифугируют в течение 10 минут при 13000 оборотах при комнатной температуре. После этого несколько раз очень осторожно промывают образовавшийся белый осадок 70%-ным этанолом. После чего в высушенную при комнатной температуре пробирку добавляют 50 мкл дистиллированной воды. Выделение ДНК заканчивается на данном этапе. После этих стадий осуществляется приготовление реакционной смеси в отдельной пробирке (общий объем реактивов составляет 20 мкл):
Очищенный биологический материал ДНК добавляется в пробирку в последнюю очередь.  Рисунок 8. Оборудование, необходимое для проведения генотипирования. А – центрифуга; Б – ПЦР амплификатор; В – машина для проведения электрофореза 2.3. Составление программы для ПЦР - амплификатора На данном этапе работы пробирки помещаются в амплификатор для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью ПЦР можно увеличить концентрацию определенных фрагментов нуклеиновых кислот в биологических материалах. Программа для амплификатора задается специально для каждого конкретного случая в зависимости от генетической последовательности, которую необходимо обнаружить. Осуществление ПЦР происходит благодаря чередующимся циклам охлаждения и нагревания реакционной смеси, содержащей ДНК. Обычно каждая программа состоит из 25-30 циклов, и обязательно включает в себя три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. В начале проходит стадия денатурации двойной цепи ДНК, разрушаются водородные связи и цепи ДНК расходятся. Данная стадия осуществляется при температуре 94-98° С и длится от 20 до 30 секунд. Затем при температуре 50-70° С в течение 30 секунд происходит реакция отжига. К одноцепочечным молекулам ДНК присоединяются праймеры. После этого, используя праймеры в качестве затравок, ДНК-Taq полимераза комплементарно реплицирует матричную цепь. Данная стадия называется элонгация и приводит к образованию новых хеликсов ДНК. В зависимости от необходимости циклы реакции могут повторяться несколько раз (табл.1). Таблица 1 Программа для ПЦР – амплификатора для линии мышей GCaMP2
2.4. Проведение электрофореза 2.4.1. Подбор необходимого материала Существует два варианта проведения электрофореза на агарозном или акриламидном геле. Материал для проведения электрофореза выбирается в зависимости от веса исследуемого гена. Так для разделения небольших (˂100 пар оснований) фрагментов ДНК используют электрофорез на акриламидном геле. Агарозные гели при полимеризации образуют поры большего диаметра и поэтому менее пригодны для электрофореза очень малых генетических фрагментов. Стоит заметить, что использование гелей с различной концентрацией агарозы приводит к различному распространению фрагментов ДНК. Более высокая концентрация агарозы снижает скорость движения генетических фрагментов, в то время как более низкие агарозные концентрации позволяют продвижению с большей скоростью. В горизонтальных гелях концентрация агарозы обычно от 0,7% до 3%. 2.4.2. Подбор уровня напряжения Увеличение напряжения, приложенного к гелю, ведет к пропорциональному усилению скорости миграции фрагментов ДНК. Поэтому для фрагментов более 2000 пар оснований лучше всего использовать напряжение не более 5 вольт на см (значение см представляет собой расстояние между двумя электродами, а не длина геля). 2.4.3. Подбор буфера Несколько различных буферов используют для электрофореза фрагментов ДНК. Наиболее часто используемый – TAE (ТРИС-ацетат-ЭДТА) и TBE (ТРИС-борат-ЭДТА). Фрагменты ДНК будут мигрировать с разной скоростью в этих буферах из-за разницы в их ионной силе. Буферы не только устанавливают значение рН, но и обеспечивают необходимые ионы для миграции ДНК. Если по ошибке использовать воду вместо буфера, то не будет никакой миграции ДНК в геле! И наоборот, если использовать концентрированный буфер (например, исходный раствор 10X), может генерироваться достаточно тепла в геле, чтобы расплавить его. 2.5. Протокол электрофореза для линии мышей GCaMP2 После того как подобраны подходящие условия, можно начинать электрофорез. Далее приведен оптимизированный протокол для проведения электрофореза мышей линии GCaMP2. Для его проведения необходимо приготовить 3%-ный агарозный гель на основе TBE раствора с добавлением бромистого этидия. Бромистый этидий способен интеркалировать между азотистыми основаниями хеликса ДНК и флуоресцировать в УФ-лучах, однако, следует отметить, что данное вещество является мутагеном и требует очень аккуратного обращения. Для получения агарозного брикета с ячейками необходимо поместить агарозный гель в специальную форму и оставить до высыхания. Затем агарозный брикет помещается в камеру для электрофореза, заполненную TBE раствором (рис.9).  Рисунок 9. Агарозный брикет с ячейками После завершения программы ПЦР-амплификатора содержимое каждой пробирки аккуратно помещается в отдельную ячейку агарозного геля. В последнюю ячейку помещается хорошо перемешенная смесь «ДНК-маркера» (DNA ladder) объёмом 1 мкл и 5 мкл маркера электрофореза (для агарозного геля подходит бромфенол синий). «ДНК-маркер» представляет собой набор фрагментов ДНК известной длины (рис. 10). Поэтому по ней можно определить длину полученного фрагмента после ПЦР и оценить, является ли этот фрагмент исследуемым «геном интереса». Для генотипирования данной линии мышей используется «ДНК-маркер» 1000 п.о., т.к. необходимые гены включают 325-400 пар азотистых оснований. Далее проводится электрофорез в течение 30 минут при напряжении равном 100 мВ. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, а более короткие молекулы двигаются быстрее. После этого агарозный гель помещают в трансиллюминатор для визуализации изображения в УФ-диапазоне.  Рисунок 10. ПЦР для линии мышей GCaMP2. А - Фотография ПЦР в реальном времени. Образцы 1,2 для гена GLT-1-tTA и 3,4 для гена tet0-G2 линии мышей GCaMP2, у образцов 1 и 2 реакция положительная, 3 и 4 реакция отрицательная, 5 - «ДНК-маркер» 1000 п.о ; Б - «ДНК-маркер» 1000 п.о. (http://www.biocompare.com/) Глава 3. Лабораторные работыЛабораторная работа №1«Приготовление TBE буфера» Цель работы: приготовить TBE буфера для приготовления агарозного брикета и дальнейшего проведения электрофореза Оборудование: аналитические весы, магнитная мешалка, стеклянные сосуды с плоским дном, pH метр, мерные колбы Материалы: NaOH, ЭДТА, ТРИС, борная кислота, деионизированная вода Ход работы: для проведения электрофореза на агарозном геле используется TBE буфер концентрации 0.5Х. Для его получения сначала необходимо приготовить 5Х сток TBE и затем развести его до необходимой концентрации Этапы работы:
Для полного растворения ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) рН раствора доводят примерно до 8,0. Для приготовления 500 мл стока 0,5 М ЭДТА необходимо взвесить 93,05 г. динатриевой соли ЭДТА (FW = 372,2). Затем растворить в 400 мл деионизированной воды и довести рН с помощью NaOH. Довести раствор водой до конечного объема в 500 мл.
Приготовить концентрированный сток (5Х) буфера TBE. Для этого на аналитических весах необходимо взвесить 54 г. ТРИСа (FW = 121.14) и 27,5 г. борной кислоты (FW = 61.83) и растворить в 900 мл деионизованной воды. После смешивания реактивов с помощью магнитной мешалки добавить 20 мл 0,5 М ЭДТА (pH 8.0) и довести раствор до финального объема в 1 л. Полученный раствор можно хранить при комнатной температуре в стеклянной бутылке. Однако при образовании осадка необходимо утилизировать данный раствор.
Для проведения электрофореза на агарозном геле, используется TBE раствор концентрации 0.5Х (1:10 разбавление 5Х стока). Развести 5Х сток в 10 раз деионизированной водой. Финальная концентрация раствора 45 мМ ТРИС-бората и 1мМ ЭДТА. Результат: Приготовлен 0.5Х TBE буфер для агарозного брикета и дальнейшего проведения электрофореза. Вопросы для самоконтроля:
Лабораторная работа №2«Приготовление агарозного брикета и заполнение его ячеек»Цель работы: приготовить 3% агарозный гель с добавлением бромистого этидия (EtBr) для дальнейшего проведения электрофореза и заполнить его ячейки реакционной смесью Оборудование: магнитная мешалка с функцией подогрева, аналитические весы, стеклянная колба с плоским дном, пипеточный дозатор, форма для агарозного брикета, pH метр, мерная колба Материалы: агар, EtBr, TBE буфер Ход работы: 3% агарозный брикет готовится на основе 0.5Х TBE буфера с последующим добавлением бромистого этидия. Данная смесь помещается в специальную форму и оставляется до полного остывания Этапы работы:
Результат: Gриготовлен 3%-ный агарозный брикет с добавлением бромистого этидия для дальнейшего проведения электрофореза и заполнен реакционной смесью. Вопросы для самоконтроля:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР Авторы: Ольга Валерьевна Тюрикова Юлия Владимировна Дембицкая Максим Сергеевич Доронин и др. Учебно-методическое пособие Государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского». 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23. Подписано в печать . Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,25. Уч.-изд. л. . Заказ № . Тираж 150 экз. Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского 603000, г. Нижний Новгород, ул. Большая Покровская, 37 |
Похожие:
 | Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки тьюторов, стажеров, руководителей и педагогических работников школ | | Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму |
| ... | | Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов ифжимк юфу |
| Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;... |  | Предгорненское районное местное отделение Общероссийского общественного благотворительного фонда |
| Методическое пособие предназначено для бакалавров III курса института геологии и нефтегазовых технологий кфу по направлению 020700.... | | Нимгирова А. С., Кульков В. Н., Набережная Ж. Б., Набережная И. Б. Организационно-теоретические аспекты экспертизы временной нетрудоспособности... |
| Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов и интернов, курсантов факультетов повышения квалификации | | Г12 Экономика отрасли (Экономика дорожного строительства): учебно-методическое пособие [Текст] / сост. В. В. Гавриш, Е. В. Гуторин.... |