Окраска капсул
Капсулы микробов состоят главным образом из полисахаридов и гликопротеидов. Капсульными можно считать те микробы, у которых капсула обнаруживается при окраске каким-либо методом на капсулы. Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Лучше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации. Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является метод Дюгида.
Метод окраски капсул по Дюгиду
На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помещают таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.
Сложенной в несколько раз фильтровальной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жидкости между ними. Препарат смотрят под большим увеличением, применяя безиммерсионные и иммерсионные объективы.
Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-черном фоне.
Метод окраски капсул по Гиссу
Взятую петлей бактериальную суспензию смешивают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.
Высушивают мазок на воздухе и мягко фиксируют его нагреванием.
Покрывают мазок красящим реактивом кристаллического фиолетового (кристалический фиолетовый 0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.
Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4 5H2O). Подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микроорганизмы — темно-фиолетовыми.
Метод окраски капсул по Антони
Высушенный на воздухе мазок окрашивают в течение 2 минут 1% (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.
Краситель отмывают 20% (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4 5H2O), удаляют избыток последнего и подсушивают фильтровальной бумагой.
Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы — темно-фиолетовыми.
Способ Михина
Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.
Микроскопическая картина: капсулы — светло-розовые, бактерии —темно-синие.
Способ Гисса
Тонкий мазок, зафиксированный на пламени, окрашивают раствором основного фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора краски + 19 частей дистиллированной воды) с нагреванием до отхождения паров, затем оставляют в покое на 30 секунд. После этого краску смывают большим количеством 20% водного раствора медного купороса и обсушивают без промывания водой между листами фильтровальной бумаги.
Микроскопическая картина: капсулы — голубого цвета, тела микробов —темно-красного, эритроциты — розового, плазма лейкоцитов — голубого, ядра лейкоцитов — темно-красного.
Способ Ольта
Мазок окрашивают 2—3% водным раствором сафранина в течение 1—3 минут с последующим быстрым смыванием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости. Благодаря прохождению световых лучей через слой воды усиливается разница в лучепреломлении капсулы и тела бактерии; под микроскопом отчетливо видны окрашенные капсулы.
Микроскопическая картина: капсулы — бледно-желтого, а бактерии —коричневого цвета.
Модификация способа Ольта.
После окраски сафранином (по оригинальной прописи) мазок докрашивают 1% водным раствором метиленовой синьки в течение 2 минут. Быстро смывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: палочки — синие, капсулы — розовые.
Способ Ребигера
Этот простой и демонстративный способ окраски состоит в том, что препарат фиксируют не пламенем, а формалином, причем фиксация происходит одновременно с окраской. Для этой цели готовят следующий раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40% формалина, дают раствору постоять несколько часов. Затем этот насыщенный при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированный мазок указанным выше раствором в течение 15—20 секунд, быстро промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: капсулы — красновато-фиолетовые, бактерии — темно-фиолетовые.
С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) на 15—20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: капсулы — бледно-розового цвета, бактерии — синие.
Способ Гусельниковой
Для выявления капсульных микробов в культурах предлагается следующий способ: каплю 3—4% водного раствора конгорот нанести на абсолютно обезжиренное предметное стекло, добавить к ней одну каплю исследуемой культуры, тщательно размешать и оставить на 5—7 минут; затем каплю размазать по стеклу, как при изготовлении мазка крови, высушить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.
Микроскопическая картина: фон — красно-розовый, капсулы —бесцветные, микроорганизмы — розовые.
Способ Кауфмана
Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут. Краску смывают водой и мазок погружают в 0,5% раствор азотнокислого серебра или в 0,25% водный раствор протаргола на 3—4 минуты, затем окрашивают карболовым раствором фуксина, разведенным в 20 раз, в течение 5—10 секунд, промывают в воде и высушивают.
Микроскопическая картина: капсулы — темно-красные, бактерии —темно-синие.
Способ Ионе
Фиксированный мазок окрашивают 2% водным раствором метилвиолета (или генцианвиолета) в течение 1—2 минут при подогревании. Краску быстро смывают небольшим количеством воды, мазок обрабатывают 2% водным раствором уксусной кислоты в течение 10 секунд, промывают в воде и высушивают.
Микроскопическая картина: капсулы — розовато-фиолетовые, бактерии — темно-фиолетовые.
Окраска спор
При исследовании живых неокрашенных препаратов, изготовленных из старых, главным образом, агаровых культур, споры чаще всего обнаруживаются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. В микробной клетке споры располагаются или в центре ее (экваториально), или на конце (терминально), или ближе к концу палочки (субтерминально). Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окрашивают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, последующим обесцвечиванием и дополнительной окраской.
Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости.
Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1% KМnO4 в 0,3н НNО3 или 0,3н НСl). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашиваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скоротечности происходящего события (менее 20 минут пребывания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 минут в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.
Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 7% (вес/объем) водный нигрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе. Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.
Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию.
Полезным методом позитивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.
Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру
Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают квадратным кусочком фильтровальной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.
Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его 5-10 минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.
Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.
Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 минут в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).
Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон — в черный.
В модифицированном методе Дорнера смешивают в пробирке водную суспензию бактерий с равным объемом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.
Метод окраски эндоспор по Шефферу–Фултону
В этом методе вместо карболового фуксина применяется 0,5%-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 минут над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой, и мазок дополнительно окрашивают 30 секунд сафранином, как при окраске по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают мазок промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый.
Метод Виртца в модификации Саватеева
К насыщенному водному раствору (около 5%) малахитовой зелени добавляют 5% глицерина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и высушивают их (лучше при 50°С). Затем готовят 0,5% водный раствор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтровальной бумаги, и высушивают. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте.
Техника окраски. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2—3 капли дистиллированной воды и накладывают полоску бумаги, окрашенной малахитовой зеленью. Препарат нагревают над пламенем до появления паров (3—4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении добавляется вода. После остывания препарата смывают краску с бумажкой струей водопроводной воды (30 секунд), и тотчас же на мокрую поверхность препарата кладут бумажку, окрашенную сафранином. Если необходимо, добавляют несколько капель воды. Через 30—40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Микроскопическая картина: свободно лежащие споры — зеленовато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток — темно-зеленые, вегетативные формы микробов — красные.
Для окраски лучше брать малахитовую зелень в виде двойной соли ZnCl2 (медно-желтые кристаллы), хуже — щавелевокислая соль (фиолетово-зеленые или ярко-зеленые кристаллы с бронзовым блеском).
Модификация Шеффер и Фултона.
На фиксированный в пламени мазок наливают насыщенный (5%) водный раствор малахитовой зелени на 30—60 секунд с подогреванием до появления паров (3—4 раза).
Краску смывают текущей водой 30—40 секунд.
Наливают 0,5% водный раствор сафранина приблизительно на 30 секунд.
Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу.
Микроскопическая картина: споры — зеленые, вегетативные формы —красные.
Способ Пешкова
Наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протрав и дифференцировки.
Приготовленный мазок:
фиксируют на пламени горелки или смесью спирта и формалина,
окрашивают кипящей леффлеровской метиленовой синькой (над пламенем горелки) в течение 15—20 секунд,
смывают водой,
докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота в течение 30 секунд,
промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: споры — голубого или синего цвета, молодые споры — черно-синие, цитоплазма вегетативных форм — розовая, хроматиновые элементы протоплазмы окрашиваются в фиолетовый цвет.
Способ Мюллера
Приготовленный на предметном стекле мазок из исследуемой культуры фиксируют на пламени.
На мазок наливают 5% водный раствор хромовой кислоты на 1—3 минуты.
Промывают препарат водой и слегка просушивают.
Через полоску чистой фильтровальной бумаги красят карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3—4 минут.
Обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение 5 секунд.
Промывают водой.
Окрашивают дополнительно леффлеровской синькой 1—2 минуты.
Промывают водой и высушивают через фильтровальную бумагу.
Микроскопическая картина: споры — красные, вегетативные формы — синие.
Способ Ауески
На приготовленный, высушенный на воздухе (нефиксированный) мазок наливают 1—2% водный раствор соляной кислоты и подогревают на пламени до появления паров (3—4 раза). Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3—5 минут. Потом препарат обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд (до бледно-розовой окраски), промывают водой и дополнительно окрашивают леффлеровской метиленовой синькой или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 2 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают.
Микроскопическая картина; споры — красные, вегетативные формы — синие (или зеленые).
Способ Клейна
готовят в пробирке густую эмульсию путем смыва исследуемой культуры физиологическим раствором,
к эмульсии прибавляют равное количество карболового раствора фуксина,
пробирку со смесью нагревают на пламени (до появления паров) в течение 5 минут,
из прогретой смеси приготовляют мазок, высушивают его и фиксируют,
обесцвечивают 1% водным раствором серной кислоты в течение 5—10 секунд,
промывают водой,
слегка подсушивают,
окрашивают леффлеровской синькой в течение 1—3 минут,
смывают водой и мазок обсушивают.
Микроскопическая картина: споры — красные, вегетативные формы — синие. Недостаток способа — значительный расход краски (фуксина).
Окраска жгутиков
Х
Рис. 3. Жгутики
бактерий
отя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем сто лет назад, существующие в настоящее время методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгутиков лежит за пределами разрешения светового микроскопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «вымазать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бактерии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы». Для обнаружения жгутиков у микробных клеток специальные прописи предусматривают применение протрав, которые способствуют осаждению на жгутиках препаратов железа или серебра —происходит искусственное наращивание поперечника жгутиков, и они лучше видны под микроскопом. При окраске на жгутики, ввиду их хрупкости, необходимо соблюдать специальные предосторожности, касающиеся как самой культуры и способа изготовления мазка, так и подготовки стекол. Культура, предназначенная для окраски на жгутики, должна быть свежей, не старше 12—20 часов роста при соответствующей температуре на твердой среде (преимущественно агаровой). Материал берут самым легким прикосновением петли к среде. Затем петлю с материалом вводят в пробирку с 2—3 мл стерильной (лучше водопроводной) воды и, держа петлю неподвижно 1—2 минуты или осторожно погружая ее 3—4 раза в воду, дают самим микробам постепенно распределиться в воде. Через 15—20 минут, когда микробы равномерно распределятся в среде, платиновой петлей осторожно берут материал и наносят на подготовленное стекло. Нанесенную каплю не размазывают по стеклу, а, дав ей подсохнуть, фиксируют на пламени или одним из химических способов фиксации. Предметные или покровные стекла для изготовления препаратов на жгутики должны быть абсолютно чистыми. Обычно стекла для этой цели обрабатывают по способу Цетнова. Дальнейшие подробности о технике окраски на жгутики даны при описании отдельных способов.
Метод окраски жгутиков по Грэю
Раствор А:
|
Дубильная кислота [20% (вес/объем) водная]
|
2 мл
|
Калийные квасцы [KAI(SO4)2∙12Н2O, насыщенные водные]
|
5 мл
|
Хлористая ртуть, насыщенный водный раствор
|
2 мл
|
Основной фуксин 3%-ный (вес/объем) в 95%-ном (объем/объем) этаноле
|
0,4 мл
|
Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием, конечный раствор отфильтровать.
Раствор Б:
|
Карболовый фуксин, приготовленный по Цилю
| Методика:
Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0,5 ч до взятия пробы в пробирку с косячком добавляют водный раствор пептона, в который переходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу центрифугируют, чтобы освободиться от составных элементов среды, промывают и вновь центрифугируют. Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 10%-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспензии.
Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45° и подсушивают препарат на воздухе.
Фильтруют прямо на мазок раствор А и оставляют его на нем приблизительно на 6 минут. Точное время следует определить экспериментально.
Раствор А смывают с предметного стекла дистиллированной водой.
На мазок кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 минуты раствором Б.
Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смотрят в микроскоп.
Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении метода зависит от использования абсолютно чистых обезжиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чистоту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзена, до тех пор пока пламя по краям стекла не становится желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 минут при 400°С (предметные стекла в печи располагают так, чтобы они не соприкасались). После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сначала протереть жидким очистителем, а затем бумажной тканью. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очищающие агенты, как хромовая кислота или 50%-ный (объем/объем) спирт.
Метод окраски жгутиков по Ляйфсону
Раствор 1:
|
Хлористый натрий
|
1,5 г
|
Дистиллированная вода
|
100 мл
|
Раствор 2:
|
Дубильная кислота
|
3,0 г
|
Дистиллированная вода
|
100 мл
|
Раствор 3:
|
Уксуснокислый n-розанилин
|
0,9 г
|
Солянокислый n-розанилин
|
0,3 г
|
Этанол 95%-ный (объем/объем)
|
100 мл
|
Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес.
Методика:
Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя.
Восковым стеклографом очерчивают вокруг мазка прямоугольник.
Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 минут; оптимальное время реакции следует определить экспериментально.
Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп.
Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет.
Окраска жгутиков серебрением
Реактивы:
I
|
40% формалин
|
1 мл
|
Дистиллированная вода
|
100 мл
|
II
|
Танин
|
5 г
|
Дистиллированная вода
|
100
|
Карболовая кислота (расплавленная)
|
1 мл
|
(Клемпарская предлагает применять, во избежание осадков, протраву в виде 2,5—3% раствора танина.)
Раствор аммиачного серебра (III) готовят по следующей методике: 4 г азотнокислого серебра растворяют в 80 мл дистиллированной воды; затем к нему по каплям добавляют крепкий (25%) аммиак, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Раствор очень стоек. Хранить в темной склянке с притертой пробкой (защищать от пыли!). Перед окраской реактив разбавляется 1:10 дистиллированной водой.
Приготовление бактериальной взвеси. Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды (ежедневные пересевы на свежие среды), пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью.
На границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы, переносят ее в пробирку, где налито 0,1—0,2 мл 1% формалина (реактив I), легкими движениями петли распределяют микробные тела в жидкости. До окраски приготовленную эмульсию держат при 37° в течение 2 часов и более (сохраняется годами).
Приготовление стекол. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают (для очистки) концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта (пинцетом!) стекла тщательно протирают мягкой чистой тряпочкой. В чашечку или бюксу, где налито 3—4 мл дистиллированной воды, очень тонкой пипеткой вносят 1 каплю формалиновой бактериальной взвеси. Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске.
Техника окраски.
На препарат (используя пинцет Корнэ!) наливают протраву (реактив II) и в течение 1—2 минут подогревают до появления паров.
Тщательно смывают протраву дистиллированной водой (удалению протравы способствует протирание стекла вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги).
Обрабатывают препарат в течение 2—2,5 минут раствором серебра (при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна (рассматривать на белом фоне или в проходящем свете!). Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Микроскопическая картина: тела бактерий — угольно-черного цвета, жгутики — в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом гомогенном фоне.
Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске.
В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава.
Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками.
Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Несмотря на то, что окрашивание жгутиков считается одной из тонких микробиологических операций, окраска по Морозову при известной пунктуальности выполнения даже в руках начинающих дает прекрасные результаты.
Способ Уварова
Особенность данного способа окраски жгутиков — отсутствие в протраве танина.
Техника окраски.
Культуру освежают двух-трехкратными пересевами на свежий агар и выращиванием при 37° в течение 15—16 часов.
Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в объеме 5 мл, осторожно погружают петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми вращениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешивают, затем добавляют в нее одну каплю формалина.
Для окраски приготовляют:
а) насыщенный водный раствор калийных квасцов;
б) раствор: сульфаниловой кислоты 0,5 г + соляной кислоты 1,5 мл + 100 мл дистиллированной воды;
в) раствор Мюра: насыщенный водный раствор калийных квасцов 25 мл + насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета - 5 мл;
г) насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Растворы «а» и «б» смешивают в пропорции 1:2. Растворы «в» и «г» смешивают в пропорции 3:1.
Окраска. Пастеровской пипеткой наносят на чистое предметное стекло каплю эмульсии и подсушивают препарат в термостате; на высохший нефиксированный препарат наливают смесь растворов «а» и «б», подогревают над пламенем при слабом отхождении паров 1—2 минуты, смывают водой и слегка высушивают. Затем на препарат наливают смесь красок «в» и «г» (раствор Мюра и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина), нагревают препарат 1—2 минуты до слабых паров, обильно промывают и высушивают.
Микроскопическая картина: жгутики — яркого красно-фиолетового или розовато-фиолетового цвета, тела бактерий — густо-фиолетовые.
Способ Леффлера
Приготовленный препарат осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5—1 минуты протравой следующего состава: 20% водный раствор танина (100 мл) + насыщенный на холоду водный раствор сернокислого закисного аммиачного железа (50 мл) + насыщенный спиртовой раствор основного фуксина (10 мл). Препарат тщательно обмывают слабой струей воды и слегка высушивают на воздухе, затем окрашивают карболовым раствором фуксина при подогревании в течение 2—3 минут, промывают водой и высушивают.
Способ Инуйе
Препарат, приготовленный со всеми предосторожностями, подогревают до появления паров в течение 1—1,5 минут в леффлеровской протраве (способ Леффлера см. выше). Затем протраву смывают водой до прекращения отхождения краски и окрашивают мазок в растворе Мюра, предварительно смешанном и профильтрованном (см. способ Уварова), над пламенем в течение 1-2 минут. Препарат после окраски промывают водой.
Бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый, а жгутики — в бледно-фиолетовый, красноватый цвет.
Способ Бениньетти и Джино
За 2—3 дня до окраски готовят следующие растворы:
Раствор сернокислого цинка (1г), 15г танина, 100 мл дистиллированной воды;
Насыщенный (при нагревании!) водный раствор квасцов;
Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета.
Непосредственно перед окрашиванием указанные растворы смешивают в пропорции 1 : 2 : 3, смесь обязательно фильтруют, затем наливают на фиксированный препарат, подогревают в течение 2—3 минут, после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: тела бактерий — темно-фиолетового цвета, жгутики — более нежной окраски. Обычно не во всех точках препарат одинаково хорошо и равномерно окрашивается.
Этот способ наиболее доступен для начинающих и дает вполне удовлетворительные результаты.
Цитоплазматические включения
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них — отложения жира, поли-β-оксимасляной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски.
Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты
Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:
Фиксированный нагреванием мазок на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5—15 минут (время определяют экспериментально).
Краситель сливают, препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу.
Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.
Дополнительно окрашивают препарат в течение 15—10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином.
Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.
Включения поли-β-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет.
Окрашивание полифосфата
Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом Мn+2РnО3n+1, выявляют следующим образом.
Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием.
Окрашивают его в течение 10—30 с в растворе метиленового синего по Леффлеру или в 1%-ном (вес/объем) толуидиновом синем.
Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.
При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы.
Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа
Этим методом выявляют гликогеноподобные вещества.
Мазок суспензии на предметном стекле фиксируют нагреванием.
На 5 минут на стекло наносят раствор перйодата [20 мл 4%-ной (вес/объем) йодной кислоты в воде, 10 мл 0,2М водного ацетата натрия и 70 мл 95%-ного этанола; защищать раствор от света!].
Отмывают стекло 70%-ным (объем/объем) этанолом.
На 5 минут наносят на предметное стекло восстанавливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2Н соляной кислоты, 10 г йодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллированной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору йодистого калия и тиосульфата натрия в дистиллированной воде сначала приливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь перемешивают и оставляют на некоторое время для выпадения в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость.
Отмывают стекло 70%-ным (вес/объем) этанолом.
Окрашивают препарат реактивом Шиффа в течение 15—45 минут (точное время следует определить экспериментально). Реактив Шиффа готовят следующим образом: 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 10 мл 2Н соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количество 2Н соляной кислоты (10мл), чтобы при высыхании на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте.
Несколько раз отмывают стекло раствором, состоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты в 500 мл дистиллированной воды.
Отмывают препарат водопроводной водой и дополнительно окрашивают 0,002%-ным (вес/объем) водным раствором малахитового зеленого в течение 2—5 с.
Отмывают препарат водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.
Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый.
Метод окраски полисахаридов альциановым синим
Для выявления полисахаридов можно также использовать альциановый синий. Обычно применяют 1%-ный (вес/объем) раствор альцианового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин. Последовательность операций такова:
Мазок препарата на предметном стекле фиксируют нагреванием.
Окрашивают мазок в течение 1 минуты разведенным в 9 раз (в воде) альциановым синим, приготовленным так, как описано выше.
Отмывают препарат водопроводной водой и высушивают.
Дополнительно очень быстро окрашивают (не следует допускать перекрашивания!) препарат карболфуксином и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают мазок на воздухе и смотрят в микроскоп.
Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный.
|
