Определение вирулентности микробов
Вирулентность — биологическое свойство микроба, характеризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видовым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезновения под влиянием различных факторов внешней среды.
Для характеристики вирулентности пользуются количественными показателями, определяющими способность исследуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулентности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она определяется не только комплексом культурно-морфологических, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении вирулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.
Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболевания, пользуются другими видами животных: крысами, морскими свинками или кроликами.
Для определения вирулентности применяют молодую культуру микроба, так как старые культуры содержат большое количество мертвых клеток.
Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изотоническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по оптическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содержалось определенное количество микробных тел. В зависимости от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количество микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может колебаться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по каким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения минимальной летальной дозы из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д.
Исследуемую взвесь бактерий вводят различными способами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраназально—в зависимости от целей и задач исследования.
Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.
Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной дозы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие данные:
количество микробов, введенных в организм животного;
способ их введения;
масса тела зараженного животного;
сроки гибели после заражения.
Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:
Минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis minima), т.e. наименьшая доза микробов, которая при определенном способе заражения, в определенных условиях опыта вызывает гибель около 95% подопытных животных.
Наименьшая безусловно смертельная доза Dll (Dosis lerie letalis) — наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт.
Средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis letalis 50%)—доза микробов, вызывающая гибель 50% зараженных животных.
Показатель LD50 позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практике экспериментальных исследований.
В отличие от Dlm и Dll, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с достаточно высокой точностью получаемых результатов.
Определение токсигенности микробов
В патологии человека большую роль играют токсигенные микроорганизмы, к которым относятся возбудители ботулизма, столбняка, газовой анаэробной инфекции, дифтерии, а также некоторые штаммы бактерий дизентерии Григорьев -Шига, стафилококка и стрептококка и некоторые другие.
Экзотоксины, вырабатываемые различными представителями этой группы микробов, обладают резко выраженной токсичностью, высокой избирательностью действия с поражением отдельных органов и тканей и способностью при парентеральном введении в организм вызывать образование антител—антитоксинов, способных нейтрализовать соответствующие им экзотоксины.
Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Бульонную культуру микроба выдерживают в термостате в течение 2—3 недель для накопления в ней токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит неразведенный токсин.
Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, являются минимальная смертельная доза (Dlm) и средняя смертельная доза (LD50).
Для определения Dlm и LD50 фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Каждую дозу токсина испытывают одновременно на 6—10 животных. Для постановки проб подбирают животных, наиболее чувствительных к исследуемому токсину. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин—на мышах.
При учете полученных результатов в протоколе опыта отмечают дозу введенного токсина, способ его введения, массу тела животного и время наступления его гибели после введения токсина.
Литература
Аристовский В.М. др. Учебник медицинской микробиологии. — М: Медгиз, 1949.
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О, — М: «Медицина», 1982.
Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. —М.: «Медицина», 1978.
Методы общей бактериологии в 3-х т. — М:, «Мир», 1983.
Розанов Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. — М:, ГИСХИ. 1952.
Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федоров В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. — М.: «Колос», 1995.
Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. — М.: Медгиз, 1958.
Оглавление
Введение 3
Бактериологическая лаборатория 3
Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 4
Правила работы и поведения в лаборатории 7
Уборка лабораторного помещения 8
Мытье и обработка лабораторной посуды 9
Дезинфекция 13
Стерилизация 14
Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования 14
Виды стерилизации 16
Микроскопические методы исследования 21
Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов 21
Приготовление мазков 26
Окраска мазков 28
Простые методы окраски мазков 31
Окраска по Муромцеву 31
Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков 32
Окраска по Граму 32
Видоизменения метода окраски по Граму 34
Окраска по Граму в модификации Хукера. 35
Окраска по Граму в модификации Берка. 36
Модификация по Синеву. 38
Модификация по Эткинсу. 39
Окраска кислотоустойчивых микробов 40
Окраска по методу Циль-Нильсена 40
Метод Труанта для окрашивания на кислотоустойчивость. 41
Метод Гонзеля 42
Метод Бунге и Траутенрота 43
Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость) 43
Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость) 43
Способ Нейссера 44
Метод Пью (окраска метахроматических зерен) 44
Окраска по Романовскому-Гимза 45
Окраска капсул 46
Метод окраски капсул по Дюгиду 46
Метод окраски капсул по Гиссу 47
Метод окраски капсул по Антони 47
Способ Михина 47
Способ Гисса 47
Способ Ольта 48
Способ Ребигера 48
Способ Гусельниковой 49
Способ Кауфмана 49
Способ Ионе 49
Окраска спор 49
Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру 50
Метод окраски эндоспор по Шефферу–Фултону 51
Метод Виртца в модификации Саватеева 51
Способ Пешкова 52
Способ Мюллера 53
Способ Ауески 53
Способ Клейна 53
Окраска жгутиков 54
Метод окраски жгутиков по Грэю 55
Метод окраски жгутиков по Ляйфсону 56
Окраска жгутиков серебрением 57
Способ Уварова 59
Способ Леффлера 60
Способ Инуйе 60
Способ Бениньетти и Джино 60
Цитоплазматические включения 61
Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты 61
Окрашивание полифосфата 61
Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа 62
Метод окраски полисахаридов альциановым синим 63
Питательные среды 63
Техника посева микроорганизмов 71
Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды 73
Получение чистых культур 74
Посев штрихом 76
Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) 77
Выделение чистой культуры по способу Дригальского 78
Анаэростат для культивирования анаэробов 78
Методы, позволяющие изучить культуральные свойства микроорганизмов 78
Рост микробов на плотной питательной среде 78
Особенности микробного роста на жидких питательных средах 81
Рост на полужидкой питательной среде 82
Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов 83
Сахаролитические свойства микроорганизмов 83
Протеолитические свойства микроорганизмов 84
Определение индола в культуре микроорганизмов 86
Определение сероводорода 86
Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов 86
Определение редуцирующей способности 87
Определение фермента каталазы 88
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам 88
Лабораторные животные 90
Краткие сведения о содержании, разведении, кормлении и заболеваниях лабораторных животных 91
Правила пополнения вивария новыми животными 93
Правила содержания экспериментальных животных в виварии 94
Уборка и дезинфекция вивария 99
Личная гигиена работников питомника (вивария) 100
Правила кормления лабораторных животных 100
Заболевания лабораторных животных 102
Подготовка животных к заражению 104
Фиксация, методы заражения и взятия крови у лабораторных животных 108
Способы заражения 112
Наркоз лабораторных животных 113
Внутрикожный метод 113
Подкожный способ заражения 114
Внутримышечный способ заражения 114
Внутрибрюшинный способ заражения 114
Внутривенное заражение кроликов 115
Внутривенное заражение крыс и мышей 115
Заражение через пищеварительный тракт 115
Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение) 117
Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод) 117
Внутримозговой метод (интрацеребральный) 118
Внутриплевральный метод 119
Содержание животных под опытом 119
Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка 119
Умерщвление и вскрытие лабораторных животных 123
Вскрытие животных 123
Определение вирулентности микробов 126
Определение токсигенности микробов 128
Литература 129
МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ
Учебно-методическое пособие
Дмитрий Аркадьевич Васильев
Анатолий Анисимович Щербаков
Лидия Владимировна Карпунина
Сергей Николаевич Золотухин
Инна Григорьевна Швиденко
|
Ульяновск 2003
|
