Методические указания му 3 1830-04
Скачать 0.71 Mb.
|
Цель метода - сравнительный анализ белкового состава и определение молекулярной массы полипептида, экспрессируемого целевым геном. Для проведения анализа используют следующие оборудование и реактивы. А. Электрофоретическая камера и источник питания (типа "Биорад" или аналоги). Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке): 1. Раствор 40\0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида); 2. Раствор 20\0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида); 3. Буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8; 4. Буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8; 5. Электродный буфер, рН 8,3; 6. Буфер образца; 7. Раствор ДСН (додецилсульфат натрия) 10%; 8. Раствор персульфата аммония 10%; 9. Раствор для окраски гелей ERZ Blue; 10. Маркеры молекулярного веса. Проведение электрофореза: I. Приготовление гелевой пластинки: - вымыть части прибора в детергенте; - промыть дистиллированной водой; - смонтировать установку для заливки гелей; - внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.; - наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку, полимеризация 10 мин. После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку. Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4 °С; использовать в течение 4 дней. II. Пробоподготовка К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280 нм), добавить буфер образца, прогреть при 100 °С 5 минут. III. Электрофорез: - поместить гелевую пластину в камеру; - заполнить камеры буфером; - нанести образцы микрошприцем; - включить источник питания; - условия: сила тока - 20 мА на пластину; - образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по молекулярной массе на основе эффекта молекулярного сита. IV. Окраска геля По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к реагенту ERZ Blue. V. Хранение Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми пленками. Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом спектре или сканируют. 5.1.2.5. Определение специфичности белка, экспрессируемого целевым геном ГММ, методом иммуноблоттинга Цель метода - идентификация экспрессируемого полипептида с помощью специфических моноклональных антител. Метод позволяет определять идентичность синтезируемого белка продукту целевого гена, указанного заявителем. Для проведения анализа используют следующие оборудование и реактивы. А. Электрофоретическая камера, камера для переноса и источник питания (типа "Биорад" или аналоги). Б. Реактивы (производства фирм, прошедших государственную регистрацию и разрешенных к использованию в установленном порядке). Проведение иммуноблоттинга I. Перенос белков После электрофоретического разделения образца в ПААГ-ДСН осуществляют перенос белков из пластин геля на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса в "полусухой" буферной системе. Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса помещают 6 листов ватмана (N 3), пропитанного раствором "С" (0,03 М Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем помещают PVDF-мембрану, затем накладывают пластину полиакриламидного геля с разделенными белками и 6 листов бумаги, пропитанной раствором "А" (0,025 М Трис, 0,04 М эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20% изопропилового спирта, 0,01% додецилсульфата лития, рН 9,4), накладывают верхний электрод (катод) и плотно прижимают. При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре. II. Обработка мембраны Для блокирования несвязавшихся с белками участков нитроцеллюлозы мембрану после переноса инкубируют в 0,1%-ном растворе Твин-20 в течение 10 минут при 37 °С, затем 30 мин. в растворе 3%-ного казеина или сухого молока. Последующие стадии обработки фильтров включают: - инкубацию с моноклональными антителами; - с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом; - окрашивание мембраны. Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 °С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают проточной водой и трижды 0,1%-ным раствором Твин-20 в течение 10 мин. Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы (-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают промыванием мембраны в воде. После высушивания окрашенные реплики сканируют. 5.1.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger. Реакцию проводят по протоколу фирмы "Promega" в 3 стадии: 1. Радиомаркирование (кинирование) праймера Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в следующих условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2; 5 мМ DTT; 0,1 мМ спермидина; 10 pmol праймера; 10 pM [32P]dATP; 5 ед. Т4-полинуклеотидкиназы. Инкубировать 30 минут на 37 °С, затем активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до 90 °С в течение 2 минут. 2. Синтез меченых цепей методом ПЦР Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых 32Р цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP. Реакция проводится в 17,5 мкл в условиях: 50 мМ Tris-HCl, рН 9,0; 10 мМ MgCl2; 1,5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5 ед. Taq-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие ddNTP, 50 мМ NaCl, раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит в следующих условиях: плавление цепей - 95 °С - 0,5 мин.; отжиг затравок - 42 °С - 0,5 мин.; элонгация цепей ДНК - 70 °С - 1 минута. Продолжительность амплификации составляет 30 циклов. Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95% формамид, 20 мМ ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола FF). 3. Электрофорез Полученные образцы прогревают 2 минуты при 70 °С и наносят на 6% полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слой геля наносят по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при постоянном напряжении (25 - 30 V/cm) при температуре 55 °С. По окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10%-ной уксусной кислоте, затем гель сушат 30 минут на стекле при температуре 60 °С. Экспонирование с рентгеновской пленкой "Кодак" проводят в течение 15 - 48 часов при комнатной температуре. 5.1.2.7. Рестрикционный анализ ампликонов Рестрикционный анализ проводят с помощью гидролиза ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами (рестриктазами) с последующим фракционированием в агарозном геле. Выбор рестриктаз определяется наличием специфических сайтов рестрикции в синтезированных ампликонах. 1. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами Для гидролиза ДНК рестриктазами используют буферные смеси с низкой, средней и высокой ионной силой, согласно рекомендациям фирм - производителей этих ферментов. Время инкубации составляет от 1 до 4 часов при 37 °С. 2. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле Разделение фрагментов ДНК проводят методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 0,8 до 3%. Электрофорез проводят при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0,04 М трис-ацетат, рН 8,1, 0,002 М ЭДТА) с содержанием 0,5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см, в течение 30 - 60 мин. Гели с разделенными фрагментами фотографируют в УФ-свете на пленку "Микрат-300" с использованием оранжевого светофильтра или осуществляют видеодетекцию полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний. 5.1.3. Методы оценки экспрессии целевого гена Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на двух уровнях. Первый уровень - транскрипционный. В этом случае определяется наличие в клетке ГММ иРНК, синтезируемой под контролем целевого гена. Второй уровень - трансляционный. В этом случае определяется наличие белкового продукта определенной молекулярной массы и/или определенной иммуноспецифичности. Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного олигонуклеотида: 20 мин. - 65 °С и 10 мин. при комнатной температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным праймером; 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ; 1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата, 0,5 мМ спермидина, 1 Ед AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 °С. Далее эту смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1). Электрофорез белка, экспрессируемого целевым геном ГММ, в ПААГ в присутствии ДСН (PAGE-SDS) Цель метода - определение молекулярного веса состава белка. Для проведения анализа используют следующие оборудование и реактивы. А. Электрофоретическая камера и источник питания. Б. Реактивы: 1. Раствор 40\0,8 (40% акриламида, 0,8% бис-акриламида); 2. Раствор 20\0,3 (20% акриламида, 0,3% бис-акриламида); 3. Буфер разделяющего геля (БРГ), рН 8,8 доводить концентрированной HCl (1,8 мл); 4. Буфер фокусирующего геля (БФГ), рН 6,8 доводить концентрированной HCl (1 мл); 5. Электродный буфер, рН 8,3, ДСН (SDS) - 4,0 г; 6. Раствор ДСН (SDS) 10%; 7. Раствор персульфата аммония 10%; 8. Раствор для окраски гелей ERZ Blue. Проведение электрофореза: I. Приготовление гелевой пластинки: - вымыть части прибора в детергенте; - ополоснуть дистиллированной водой; - смонтировать установку; - внести разделяющий гель, полимеризация 30 мин.; - наслоить фокусирующий гель и вставить гребенку. После полимеризации (10 мин.) одномоментно удалить гребенку. Гель можно хранить в полиэтилене, целлофане при температуре 4 °С; использовать в течение 4 дней. II. Пробоподготовка К образцу, содержащему ~ 1 мг/мл белка (по поглощению при 280 нм), добавить буфер образца с дитиотрейтолом, инкубировать при 100 °С 3 минуты. III. Электрофорез: - поместить гелевую пластину в камеру; - заполнить камеры буфером; - нанести образцы микрошприцем; - включить источник питания; - условия: ток - 20 мА на пластину; - образцы концентрируются на анодном конце, затем разделяются по молекулярному весу на основе эффекта молекулярного сита. IV. Окраска По окончании электрофореза гель вынуть из кассеты, поместить в камеру для окраски. Окраска согласно протоколу, прилагаемому к реагенту ERZ Blue. V. Хранение Для консервации применяют высушивание геля между целлофановыми пленками. Для сохранения данного изображения гель фотографируют в видимом спектре или сканируют. Иммуноблоттинг (Western-blotting Immunoassay) Метод иммуноблоттинга позволяет с помощью специфических моноклональных антител определять идентичность синтезируемого белка продукту целевого гена, указанного заявителем. После электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS) белки переносят из пластин геля на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса в "полусухой" буферной системе. Для этого на нижний угольный электрод (анод) ячейки для переноса помещают 6 листов фильтровальной бумаги (W N 3), пропитанной раствором "С" (0,03 М Трис, 20% изопропилового спирта, рН 10,0). Следующим слоем помещают нитроцеллюлозную мембрану ВА 85, затем накладывают пластину полиакриламидного геля с разделенными белками и 6 листов бумаги, пропитанной раствором "А" (0,025 М Трис, 0,04 М эпсилон-аминокапроновой кислоты, 20% изопропилового спирта, 0,01% додецилсульфата лития, рН 9,4), накладывают верхний электрод (катод) и плотно прижимают. При сборке системы следят, чтобы между слоями не было пузырьков воздуха. Размер листов фильтровальной бумаги и нитроцеллюлозных фильтров должен соответствовать размеру геля. Перенос проводят при постоянном токе 100 мА в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Обработка мембраны. Для блокирования не связавшихся с белками участков нитроцеллюлозы мембрану после переноса инкубируют в 0,1% растворе Твин-20 в течение 10 минут при 37 °С, затем 30 мин. в растворе 3% казеина. Последующие стадии обработки фильтров включают: - инкубацию с моноклональными антителами (поликлональными антителами); - с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом; - окрашивание мембраны. Условия инкубации на каждой стадии: 1 час на шейкере при 37 °С. После окончания каждой стадии инкубации фильтр трижды отмывают проточной водой и трижды 0,1% раствором Твин-20 в течение 10 мин. Проявление зон осуществляют субстратным раствором пероксидазы (-хлорнафтол, диаминобензидин). Реакцию окрашивания останавливают промыванием мембраны в воде. После высушивания окрашенные реплики сканируют. 5.2. Определение ДНК ГММ в готовых продуктах питания Полная микробиологическая и молекулярно-генетическая, медико-биологическая и технологическая оценка ГММ проводится для пищевых продуктов 1 группы (см. п. 3.4 настоящих МУ). Такая оценка предусматривает наряду с анализом документации как исследования культур ГММ (таксономии и свойств доноров, реципиентов, самих ГММ, последовательностей генных вставок, наличия биомаркеров и т.д.), так и продуктов с ГММ. Для продукции, относимой ко второй группе (само по себе длительное использование которой в питании населения без вреда для здоровья является одним из свидетельств безопасности), основными подходами могут быть микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка образцов готовых продуктов (идентификация ДНК генной вставки, наличие селективных маркеров или маркеров генной модификации (векторных генов, линкеров и т.п.); либо комплексная фено- и генотипическая идентификация выделенного из продукта ГММ *) и/или экспертиза документации. ________________ * При экспертизе продуктов, содержащих жизнеспособные ГММ. Стандартно принятыми методами для определения наличия чужеродного генетического материала в продуктах являются иммунологический анализ и выявление ДНК ГММ при помощи ПЦР. Критерием в пользу выбора ПЦР как метода анализа является высокая чувствительность метода, превосходящая как минимум на два порядка чувствительность известных иммунологических методов. Помимо этого, ПЦР является гораздо менее дорогим и более стабильным методом, чем другие методы анализа. Немаловажным достоинством ПЦР является то, что используемые в реакции синтетические олигонуклеотиды при правильном их выборе могут быть применены для проведения анализов различных ГММ, что в случае иммунологических методов невозможно. 5.2.1. ПЦР-идентификация ДНК ГММ в готовых продуктах питания 5.2.1.1. Выделение ДНК ГММ из тестируемого продукта В выборе метода выделения ДНК определяющую роль играет содержание жиров в продуктах питания. При повышенном содержании жиров проводится дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой. Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка. Обычная длина ПЦР фрагмента при выявлении ДНК ГММ не превышает 1000 пар оснований, поэтому в основу нижеследующих методик легли процедуры выделения и очистки, позволяющие получить достаточно чистые препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым критерием отбора методик явилось требование минимизации времени, затрачиваемого на выделение одного препарата ДНК. 1. 0,5 г образца пищевого продукта гомогенизируют при помощи тефлонового пестика в 0,5 мл буфера А (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 50 mM NaCl, 10 мМ -меркаптоэтанола). 2. После гомогенизации добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 20 - 30 мин. при 65 °С. 3. Охлаждают до 4 °С, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия, перемешивают в вортексе и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. при комнатной температуре. 4. К надосадку добавляют 1 мл смолы Wizard MaxiPreps и инкубируют смесь 10 мин. при 25 °С. 5. Затем фильтруют полученную смесь сквозь мини-колонку, промывают 2 мл 80%-ного изопропанола, центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и удаляют оставшийся в мини-колонке изопропанол. 6. Добавляют в мини-колонку 50 мкл дистиллированной воды, подогретой до 65 °С. 7. Инкубируют мини-колонку с водой 10 мин. при 65 °С, центрифугируют (15000 об./мин., 2 мин.) и переносят раствор ДНК в чистую стерильную пробирку. В зависимости от содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на проведение единичной полимеразно-цепной реакции в объеме 50 мкл требуется от 2 до 20 мкл полученного препарата ДНК. Образцы пищевых продуктов с повышенным содержанием масла перед выделением ДНК требуется подвергнуть дополнительной экстракции эмульсией хлороформа в воде. Для этого 0,5 г исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5 мл буфера А и 0,5 мл хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56 °С. Затем охлаждают его до 4 °С и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. на микроцентрифуге при комнатной температуре. Водную фазу собирают и переносят в чистую пробирку. Далее продолжают, начиная с пункта 2 вышеизложенной методики. 5.2.1.2. Выбор праймеров для проведения ПЦР Для точного определения наличия ДНК вставки в штаммах ГММ фирмой-заявителем должна быть представлена информация о нуклеотидной последовательности целевого гена и его регуляторных элементов, а также о структурных элементах и маркерах вектора. Это требование вводится для того, чтобы можно было точно идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В таком случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия генетических модификаций. Длина используемых при анализе специфических праймеров должна составлять не менее 20 пар нуклеотидов с целью избежания появления в результате ПЦР неспецифических продуктов реакции. В случае, когда подобная информация по каким-то причинам не может быть представлена (например, фирма - изготовитель продуктов питания закупает используемые в технологическом процессе штаммы микроорганизмов у специализированного производителя), необходимо проводить проверку на присутствие в выделяемой из тестируемой продукции ДНК наборами праймеров, позволяющими подтвердить видовую идентификацию штамма и выявить наличие возможных генетических модификаций. Рекомендуемые стратегии выявления генетических модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов. Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о возможных незадокументированных генетических модификациях, что потребует проведения дополнительных исследований, подтверждающих или опровергающих это предположение. 5.2.1.3. Выбор условий проведения ПЦР Для ПЦР-анализа ДНК, выделенной из продуктов питания, подбираются оптимальные условия проведения реакции для каждой конкретной пары праймеров, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность анализа, исключающую наличие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК. Выбор условий проведения ПЦР включает подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов. 5.2.1.4. Проведения ПЦР Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при 25 °С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркапто-этанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным программам в многоканальном амплификаторе ДНК. При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения специфичности реакции. Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В). ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем электрофореза в 2%-ном агарозном геле с последующей видео- или фотодетекцией, полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний. Приложение |
Похожие:
 | Методические указания предназначены для студентов заочной формы обучения по специальности Техническое обслуживание и ремонт автомобильного... |  | Методические рекомендации печатаются по решению Методического Совета гбоу спо со «еэтк» |
| Номинация: «методические рекомендации по освоению учебной дисциплины, междисциплинарного курса, профессионального модуля» | | Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... |
| Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... | | Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... |
| Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... | | Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании пцк по укрупненной группе 140000 Электроснабжение (нпо и спо) |
| Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический... | | Методические указания к выполнению курсовых и дипломных проектов (работ) по специальности «Электромеханика». – Ростов н/Д: Рост гос... |