Методические указания му 3 1830-04
Скачать 0.71 Mb.
|
5. Молекулярно-генетическая оценка ГММ, используемых для производства пищевой продукции Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертом центра по микробиологической и молекулярно-генетической экспертизе ГММ при ГУ НИИЭМ им. Гамалеи РАМН. Это обусловлено большим разнообразием последовательностей чужеродной ДНК, которые могут быть встроены в геном ГММ. Эксперт обязан проанализировать представленную заявителем документацию, соответствующие базы данных (в т.ч. и международные) и составить перечень необходимых исследований в зависимости: 1) от сложности конструкции ГММ; 2) характера и места использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов; 3) вероятности попадания живых ГММ в организм человека. Для точной идентификации таксономического положения и свойств ГММ (при необходимости - штаммов - доноров и реципиентов) фирма-заявитель должна представить паспорт штамма и/или справку о депонировании в национальных или иных международно признанных коллекциях культур микроорганизмов, в коллекциях научно-исследовательских организаций с указанием: 1) наименования штамма в соответствии с действующей международной номенклатурой (род, вид, номер штамма); 2) источника выделения; 3) сведений, подтверждающих безопасное использование данного штамма и/или продуктов, выработанных с его применением, в питании людей (Инвентарный перечень GRAS FDA, свидетельства о свободной продаже в стране-изготовителе); для штаммов - продуцентов ферментных препаратов и пищевых веществ - сведения о соответствии штамма СанПиН 2.3.2.1293-03 "Гигиенические требования к применению пищевых добавок", Перечню Комиссии Кодекс Алиментариус, General Requirements, V. 1A; 4) сведений о непатогенности и нетоксигенности; 5) сведений о стабильности генома; 6) сведений о профиле антибиотикорезистентности; 7) сведений о резистентности к кислоте и желчи (для пробиотиков); 8) способности к симбиозу с резидентной микрофлорой ЖКТ (для пробиотиков); 9) способности к адгезии (для пробиотиков); 10) способности к продукции биологически активных субстанций; 11) способности к иммуностимулирующему эффекту (для пробиотиков). Для подтверждения таксономического положения штамма заявитель должен представить информацию об уровне гомологии ГММ (в случае необходимости штаммов - донора и реципиента) с штаммами этого вида, допущенными для использования в пищевой промышленности при создании аналогичной продукции. Также должны быть предоставлены данные сравнения фенотипических свойств ГММ с характерными фенотипическими свойствами его вида, описанными в определителе Берги (Bergey's manual of systematic bacteriology. Eds. Sneaht P.N.D. et al. Baltimore; Williams and Wilkins, V. 2, 1986). Заявитель (поставщик) должен представить информацию о нуклеотидной последовательности генной вставки, а также материалы, отражающие молекулярно-биологические характеристики ГММ (см. п. 3.3 настоящих МУ). 5.1. ПЦР-идентификация чужеродного генетического материала в штаммах ГММ Согласно рекомендациям ФАО/ВОЗ стратегия выявления генетических модификаций у микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов, должна быть направлена на выявление максимального количества потенциальных рисков. Поэтому экспертные исследования штаммов ГММ должны включать, с одной стороны, подтверждение природы штамма-реципиента и целевой вставки чужеродной ДНК (согласно представленной заявителем документации), а с другой стороны, выявлять наличие возможных генетических модификаций, не указанных в документации. Рекомендуемые стратегии выявления генетических модификаций предлагают использовать для этих целей наиболее часто употребляемые векторные последовательности: селективные гены (гены антибиотикорезистентности, бактериоцинов или ауксотрофные селективные маркеры), неэкспрессируемые последовательности (полилинкеры, промоторы или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов. Обнаружение таких последовательностей будет свидетельствовать о возможных незадокументированных генетических модификациях, что потребует проведения дополнительных исследований штаммов ГММ. С точки зрения безопасности пищевые ГММ не должны содержать гены антибиотикорезистентности, встроенная ДНК не должна кодировать выработку потенциально опасных веществ, а векторы класса food-grade должны быть сконструированы таким образом, чтобы свести к минимуму вероятность передачи нового генетического материала другим микроорганизмам. Проведение дополнительных исследований может потребовать использования таких методов, как различные виды гибридизационного и рестрикционного анализа, секвенирование, анализ функционирования вставки (ОТ-ПЦР и изучение продукции белка чужеродной ДНК). Однако основным скрининговым методом является полимеразная цепная реакция - ПЦР. Специально подобранные пары праймеров будут использованы как для проверки целевого гена, так и для последовательностей, свидетельствующих о возможных генетических модификациях. В настоящее время методы молекулярной биологии, основанные на ПЦР-анализе, находят все более широкое применение в целях диагностики и экспресс-анализа разнообразного биологического материала. Преимущество подобных методик обусловлено высокой чувствительностью и специфичностью ПЦР, совместимостью ПЦР-анализа с дополнительными методами исследования (секвенирование, рестрикционный и гибридизационный анализы амплифицированных фрагментов, изучение информационных РНК (ОТ-ПЦР) и транслируемого ими белкового продукта). Достоинством ПЦР-анализа являются также высокая воспроизводимость результатов, технологичность проведения анализа в сочетании с доступностью и сравнительно невысокой стоимостью оборудования для организации ПЦР-лабораторий. 5.1.1. Метод идентификации целевых генов, неэкспрессируемых последовательностей и селективных маркеров, а также подтверждение видовой принадлежности штамма при помощи ПЦР 5.1.1.1. Создание электронной базы данных Для полной и надежной идентификации конкретного ГММ необходимо создать электронную базу данных о целевых, селективных и маркерных генах, мигрирующих элементах, неэкспрессируемых последовательностях и регуляторных элементах, а также векторных конструкциях класса food-grade, которые используются при создании ГММ. В такую базу данных должна быть включена информация о видоспецифических генах, которые могут быть использованы для подтверждения таксономической принадлежности штамма. Также в базу данных должны быть включены сведения о наличии в коллекциях штаммов ГММ, принадлежащих к 1, 2 и 3 классу безопасности, в различных странах. Особое внимание при создании электронной базы данных следует уделить информации о так называемых GRAS (generally recognized as safe) микроорганизмах, которые чаще всего используются как доноры генетической информации при конструировании ГММ. 5.1.1.2. Выбор праймеров Для проведения экспертизы ГММ выбор праймеров должен проводиться по следующим позициям: 1) для идентификации таксономической принадлежности микроорганизма (гены 16S/23S рРНК или другие специфические последовательности); 2) для идентификации целевых генов генетической вставки (гены, кодирующие продукцию технологически важных ферментов, например таких, как химозин; гены устойчивости к бактериофагам; гены - регуляторы уровня кислотности; гены устойчивости к этанолу и другим стрессовым факторам); 3) для идентификации генов селективных маркеров (гены устойчивости к антибиотикам, бактериоцинам, ауксотрофным селективным маркерам); 4) для идентификации маркерных (screenable) векторных генов (гены Е. coli, кодирующие -галактозидазу или -глюкоронидазу, или гены бактериофага Т7, кодирующие РНК полимеразу); 5) для идентификации неэкспрессируемых последовательностей (полилинкеры, промоторы и терминаторы); 6) для идентификации мигрирующих элементов, используемых для создания транспозируемых векторов (например, Ту-элементы). Выбор праймеров должен осуществляться в соответствии с правилами молекулярного дизайна. Для выбора праймеров должны быть использованы программы Primer, Oligo или другие аналогичные программы, позволяющие осуществлять многофакторный анализ выбранных последовательностей. Должен быть произведен сравнительный анализ выбранных олигонуклеотидов с помощью программы Blast для исключения наличия областей гомологии с ДНК родственных и неродственных видов. Конкретный набор тех или иных праймеров для проведения экспертизы должен определяться таксономической принадлежностью штамма; информацией о его генетическом статусе и характере генетических модификаций, предоставленной заявителем; а также характера и места использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов и вероятности попадания живых ГММ в организм человека (см. п. 3.4 настоящих МУ). Выбор, синтез и очистка праймеров производится в Центре по микробиологической и молекулярно-биологической экспертизе ГММ при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. 5.1.1.3. Выбор условий проведения ПЦР Условия проведения реакции определяют степень точности и воспроизводимости результатов, и их отработка должна производиться для каждой конкретной пары праймеров. Выбор условий проведения ПЦР включает подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР обеспечивает высокий уровень чувствительности и специфичности прохождения реакции, исключающий наличие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР осуществляется сотрудниками Центра по микробиологической и молекулярно-биологической экспертизе ГММ при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. 5.1.1.4. Выделение ДНК из культур ГММ и проведение ПЦР 5.1.1.4.1. Аппаратура и инструментарий
5.1.1.4.2. Лабораторная посуда и материалы
5.1.1.4.3. Реактивы Допускаются к использованию реактивы производства различных отечественных и зарубежных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.
5.1.1.4.4. Приготовление основных растворов 1 М Трис рН-7,5. Растворить 121,1 г Трис в 800 мл воды. Довести рН до необходимого значения добавлением концентрированной HCl и довести объем до 1 л. Раствор простерилизовать. 0,5 М ЭДТА рН-8,0. К 186,1 г ЭДТА добавить 800 мл воды. Довести рН до 8,0 NaOH. 5 M NaCl (х. ч. или ч. д. а.). 29,22 г NaCl растворить в 80 мл воды, довести объем до 100 мл, простерилизовать. 10%-ный SDS. 10 г SDS растворить в 90 мл воды, чтобы ускорить растворение можно нагреть раствор до 60 °С. Довести рН до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной НСl и довести до 100 мл. Внимание! При взвешивании SDS наденьте на лицо маску, т.к. при попадании на слизистую оболочку носоглотки этот летучий порошок вызывает сильное раздражение. 5 М Ацетат калия. 49,1 г ацетата калия растворить в 80 мл воды и довести объем до 100 мл. 70%-ный этанол. Для приготовления 100 мл раствора требуется 73 мл 96% этанола и 27 мл воды. 5.1.1.4.5. Выделение ДНК из штамма ГММ Для выделения ДНК из штамма ГММ может применяться фенол-хлороформный или другой адекватный метод. Однако наиболее надежные результаты в ПЦР дает ДНК, выделенная непосредственно перед постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты по методу Бирнобойма и Доли: 20 - 40 мкл оттаявшей бактериальной массы суспендируют в 100 мкл буфера I (50 mМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 mМ ЭДТА, 50 мкг/мл РНКазы). К суспензии добавляют 120 мкл лизирующего буфера (0,2 М NaOH, 1% SDS) и ожидают лизиса бактерий, видимого по возрастанию вязкости суспензии. После этого комплекс бактериальных белков и обломков клеточной стенки осаждают добавлением 100 мкл 2,55 М ацетата калия при энергичном встряхивании на вортексе в течение 5 мин. Затем смесь центрифугируют в течение 5 - 10 мин. Надосадочную жидкость переносят в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 0,75 мл смолы марки Wizzard. Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через мини-колонку; промывают осадок смолы в мини-колонке 2 мл 80% изопропанола и центрифугируют 1 мин. при 12000g для удаления остатков жидкости. Мини-колонку помещают в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, наносят в мини-колонку 50 мкл стерильной бидистиллированной или деионизованной воды и прогревают пробирку с колонкой 5 мин. при плюс 70 °С. Затем мини-колонку в пробирке помещают в центрифугу и центрифугируют 1 мин. при максимальной скорости для переноса раствора ДНК в пробирку. Описанным способом получают порядка 5 мкг ДНК размером от 3 до 15 т.п.н. Полученные препараты ДНК сохраняются при минус 70 °С и используются для анализа методом ПЦР. При условии использования стерильных растворов и посуды получаемая ДНК может храниться при плюс 4 °С в течение полугода. Срок хранения препаратов ДНК при минус 20 °С превышает 2 года. 5.1.1.4.6. Проведение ПЦР ПЦР осуществляют с помощью ДНК-амплификаторов (термоциклеров). Для проведения ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров. В типичных экспериментах реакционную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к реакционной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0 при 25 °С), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 15 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл минерального масла и реакцию проводят по специально подобранным программам в многоканальном амплификаторе ДНК. При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для анализа нескольких важных фрагментов вставки, а также второго раунда ПЦР с внутренней парой праймеров (nested PCR) для повышения специфичности реакции. Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В). ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu 1. Окрашивание фрагментов ДНК осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе. Допустимо анализ продуктов ПЦР производить путем электрофореза в 2% агарозном геле с последующей видео- или фотодетекцией полученной на трансиллюминаторе картины. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний. 5.1.2. Дополнительные методы идентификации генетического материала ГММ Дополнительными и уточняющими методами идентификации генетической информации в штаммах ГММ являются рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов ДНК, а также метод определения их нуклеотидной последовательности (секвенирование). 5.1.2.1. Аппаратура и инструментарий Допускаются к использованию аппаратура и инструментарий производства различных отечественных и зарубежных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке. 1. Спектрофотометр. 2. Весы аналитические. 3. Планшетный ридер (rider). 4. Планшетный вошер (wosher). 5. Прибор для проведения электрофореза. 6. Прибор для проведения иммуноблоттинга. 7. Источник тока. 8. Термостатируемый шейкер. 9. Центрифуга настольная типа "Эппендорф". 10. Холодильник бытовой. 11. Компьютер, монитор, сканер, принтер. 12. Пипетки многоканальные и одноканальные с переменным объемом. 5.1.2.2. Методы оценки экспрессии целевого гена Оценка экспрессии встроенного целевого гена осуществляется на двух уровнях. Первый уровень - транскрипционный. В этом случае определяется наличие в клетке ГММ и РНК, синтезируемой под контролем целевого гена. Второй уровень - трансляционный. В этом случае определяется наличие белкового продукта определенной молекулярной массы и/или определенной иммуноспецифичности. 5.1.2.3. Определение иРНК, транскрибируемых с целевого гена методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 1 мкг РНК, выделенной из клеток культуры ГММ, предварительно обработанной ДНКазой, отжигали с 10 пмоль одноцепочечного олигонуклеотида: 20 мин. - 65 °С и 10 мин. при комнатной температуре. Затем проводили реакцию обратной транскрипции в общем объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным праймером, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ КСl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ; 1 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 0,5 мМ спермидина; 1 Ед AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин. при 42 °С. Далее эту смесь анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (методика проведения ПЦР описана в разделе 5.1.1). 5.1.2.4. Определение белка, экспрессируемого целевым геном ГММ, методом электрофоретического разделения в ПААГ-ДСН |
Похожие:
 | Методические указания предназначены для студентов заочной формы обучения по специальности Техническое обслуживание и ремонт автомобильного... |  | Методические рекомендации печатаются по решению Методического Совета гбоу спо со «еэтк» |
| Номинация: «методические рекомендации по освоению учебной дисциплины, междисциплинарного курса, профессионального модуля» | | Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... |
| Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... | | Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... |
| Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... | | Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании пцк по укрупненной группе 140000 Электроснабжение (нпо и спо) |
| Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический... | | Методические указания к выполнению курсовых и дипломных проектов (работ) по специальности «Электромеханика». – Ростов н/Д: Рост гос... |