Методические указания му 3 1830-04
Скачать 0.71 Mb.
|
| 4.2. Определение патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и референтного (контрольного) штамма При выявлении четко выраженной гемолитической и адгезивной активности ГММ и штамма-реципиента обязательными тестами на патогенные свойства ГММ и штамма-реципиента является определение вирулентных свойств ГММ и штамма-реципиента с использованием тканевых культур (HeLa, Hep-2, CHO), определением LD50 на модели беспородных мышей, интраназальной легочной модели, инвазивных свойств на тканевых культурах и в кератоконъюнктивальном тесте по Sereny. В зависимости от принадлежности ГММ и штамма-реципиента к определенному виду микроорганизмов выбираются наиболее адекватные методы определения вирулентных и инвазивных свойств ГММ. Ниже приведены методы, которые могут быть использованы в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ при приведенных выше условиях. 4.2.1. Определение гемолитической активности ГММ и штамма-реципиента Определенные виды микроорганизмов продуцируют гемолизины, считающиеся факторами патогенности у бактерий, в связи с чем продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности. Определение гемолитической активности проводится в 2 этапа. На 1-м этапе на 5%-ный кровяной агар высевают исследуемый ГММ и штамм-реципиент. При продукции гемолизина через 18 - 24 часа при культивировании чашек Петри при оптимальной температуре развития гемолиза исследуемым ГММ вокруг колоний образуется видимая зона гемолиза и тем большая, чем больше гемолизина продуцируют ГММ и штамм-реципиент. При выявлении продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом проводят 2-й этап исследования, определяя титр гемолитической активности супернатантов ГММ и штамма-реципиента. 4.2.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды, используемые для определения патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма вида, к которому относится ГММ 4.2.2.1. Аппаратура и инструментарий
4.2.2.2. Лабораторная посуда и материалы
4.2.2.3. Реактивы и питательные среды
Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке. 4.2.2.4. Проведение анализа Взвесь эритроцитов человека, барана или другого вида млекопитающего добавляют к охлажденной до 50 - 55 °С плотной питательной среде с таким расчетом, чтобы взвесь эритроцитов составляла в агаре 5%. Смесь аккуратно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания чашек на поверхность 5%-ного кровяного агара высевают в разведениях культуру ГММ или штамма-реципиента для формирования отдельных колоний. После посева чашки инкубируют в зависимости от вида микроорганизма в течение 24 - 48 часов при оптимальной для него температуре развития. Затем чашки Петри вынимают из термостата и осуществляют учет результатов. При продукции ГММ и штаммом-реципиентом гемолизина вокруг колоний формируются зоны гемолиза и тем большие, чем больше гемолизина продуцируют ГММ и штамм-реципиент. При выявлении феномена продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом с колонии петлей осуществляют взятие материала, который высевают в пробирку с 3 мл обогащенной жидкой питательной среды (например, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты). Пробирки инкубируют в течение 24 - 48 часов при оптимальной для ГММ температуре, после чего выращенные бактериальные клетки центрифугируют в центрифуге при 6000 об./мин. в течение 15 минут. Супернатант аккуратно отбирают наконечником микропипетки и переносят в чистую пробирку. Затем готовят 1%-ную взвесь эритроцитов барана или человека и разливают в пробирки по 1 см3 (макрометод) или в U-лунки планшет по 0,1 см3 (микрометод). Добавляют равный объем супернатанта исследуемого ГММ и штамма-реципиента. Инкубируют в течение 1 часа при 35 - 37 °С и производят предварительный учет результатов. Окончательный учет результатов осуществляют через 18 - 24 часа инкубации смеси эритроцитов и супернатанта при температуре 18 - 20 °С. При положительном результате наблюдается гемолиз эритроцитов, представляющий визуально окрашенный прозрачный бульон. Последняя пробирка или лунка, в которой наблюдается гемолиз, отражает титр (количество) гемолизина, продуцируемого ГММ или штаммом-реципиентом. При отрицательном результате на дне пробирки или лунки формируется "пуговка" эритроцитов без изменения цвета бульона. Контроли: отрицательный - вместо супернатанта добавляется равный объем стерильного бульона, в котором проводилось выращивание культур; положительный - штамм гемолизпродуцирующей кишечной палочки, выращиваемый в тех же условиях, что и ГММ и штамм-реципиент. 4.3. Определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента Для пробиотиков определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента является обязательным методом в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ, используемых в производстве пищевых продуктов. Для остальных видов ГММ определение адгезивности осуществляется на основании предварительного анализа справочных и нормативных документов, поступающих на экспертизу вместе с ГММ и штаммами-реципиентами. Адгезивные свойства ГММ могут быть исследованы на ряде биологических моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов) и методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных. Наиболее простым и универсальным методом определения адгезивных свойств бактерий является выявление способности микроорганизмов вызывать гемагглютинацию эритроцитов человека и животных. В связи с этим адгезивность ГММ и штамма-реципиента первоначально будет определяться методом гемагглютинации. При выявлении способности ГММ и штамма-реципиента агглютинировать эритроциты человека и животных далее, в зависимости от вида ГММ, будет использоваться одна из биологических моделей на животных. 4.3.1. Определение адгезивности ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма в отсутствие D-маннозы Адгезивные свойства ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма первоначально определяются методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных (мыши, крысы, кролика, барана и др.) в отсутствие D-маннозы (маннозо-чувствительная адгезия). При этом метод может выполняться в макро- (пробирках) и микровариантах (планшетах). Выполнение метода включает следующие этапы: - приготовление взвеси эритроцитов; - приготовление суспензии микроорганизма; - внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов; - внесение в пробирки или в лунки планшет суспензии культуры ГММ; - аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии культур; - инкубация в термостате при 37 °С в течение 1 часа; - предварительный учет результатов; - инкубация смеси эритроцитов и суспензии микроорганизма при комнатной температуре в течение 18 часов; - окончательный учет результатов. Постановка реакции гемагглютинации с эритроцитами человека или животных включает следующие этапы. Приготовление взвеси эритроцитов. Из тщательно отмытых эритроцитов готовят 1%-ную взвесь в стерильном физиологическом растворе. С этой целью к 1 см3 эритроцитов, помещенных в 200 см3 колбу, добавляют 99 см3 стерильного физиологического раствора. Взвесь аккуратно перемешивают до образования однородной суспензии. Приготовление суспензии ГММ. ГММ, выращенный на плотной питательной среде, смывают стерильным физиологическим раствором и готовят суспензию клеток в концентрации 1 109 КОЕ/см3, используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или стандарт McFarlane (N1-7). Приготовленную 1%-ную взвесь эритроцитов вносят по 1 см3 в пробирки или по 0,1 см3 в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензию ГММ и взвесь аккуратно перемешивают. Пробирки закрывают пробками, планшет крышкой и помещают в термостат при температуре, оптимальной для исследуемого вида ГММ, на 1 час. После инкубации пробирок или планшета в термостате их вынимают и проводят предварительный учет результатов. При наличии адгезивных свойств у ГММ эритроциты распределяются равномерно по всей поверхности дна. При отрицательном результате все эритроциты собираются в виде точки в середине дна пробирки или лунки планшета. Окончательные результаты исследования учитывают через 18 часов после инкубации пробирок или планшета при комнатной температуре. 4.3.2. Определение адгезивности ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма в присутствии D-маннозы При выявлении выраженной гемагглютинационной активности ГММ или штамма-реципиента ту же реакцию проводят с использованием d-маннозы для определения маннозо-чувствительной или маннозо-резистентной адгезии. Постановка метода в данном варианте проводится аналогично пункту 4.3.1, к которому добавляется ряд пробирок или лунок, в которые внесена 1% D-манноза. В случае маннозо-чувствительной гемагглютинации (адгезии) наблюдается оседание эритроцитов в виде точки в середине дна пробирки или лунки. Маннозо-устойчивая гемагглютинация наблюдается и при добавлении d-маннозы в реакционную взвесь. При выявлении гемолитической и адгезивной активности у ГММ и штамма-реципиента в экспериментах in vitro необходимы исследования на экспериментальных моделях in vivo. 4.4. Определение вирулентности ГММ, штамма-реципиента и референтного (контрольного) штамма 4.4.1. Аппаратура, материалы и инструментарий 4.4.1.1. Аппаратура и инструментарий
4.4.1.2. Лабораторная посуда и материалы
4.4.1.3. Реактивы и питательные среды
4.4.2. Описание метода Группам мышей, по 10 животных каждая, вводят внутрибрюшинно по 0,1 см3 живой культуры ГММ, штамма-реципиента или контрольного штамма в концентрации 1 х 109, 1 х 107, 1 х 105 и 1 х 103 КОЕ/см3. Каждую группу животных помещают в отдельную клетку и далее наблюдают в течение 10 дней за гибелью животных. В качестве контролей используют группы животных (по 10 шт.), которым внутрибрюшинно вводят: а) стерильный физиологический раствор и б) вирулентный штамм определенного вида с установленной ранее дозой LD50. 4.4.3. Учет результатов По завершении срока наблюдения подсчитывают гибель животных в каждой группе. LD50 рассчитывают по формуле: lgLD50 = lg DN - (Li - 0,5), где: N - общее число испытанных доз; n - число животных, которым введена каждая доза; - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей, т.е. логарифм кратности испытанных разведений; Li - отношение числа животных, погибших от введения данной дозы, к общему числу животных, которым эта доза введена, индекс i соответствует номеру дозы, если считать наименьшую из испытанных доз первой; Li - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз; Di - величина дозы (номер i); DN - максимальная, D1 - минимальная из испытанных доз. ГММ и штамм-реципиент считаются авирулентными, если LD50 равна 5 108 КОЕ/см3 и более. При идентичных показателях LD50 у ГММ и штамма-реципиента можно считать, что осуществленная генетическая модификация не повлияла на вирулентные свойства ГММ. 4.5. Определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента in vivo При подтверждении гемагглютинационной активности ГММ или штамма-реципиента с использованием d-маннозы возможно количественное определение адгезии in vivo при использовании биологических моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов). Ниже приведено описание модели для исследования адгезивной активности штаммов микроорганизмов на модели перевязанной петли тонкого кишечника 12 - 14-дневных крольчат. 4.5.1. Материалы и инструментарий 4.5.1.1. Аппаратура и инструментарий
4.5.1.2. Животные и штаммы 12 - 14-дневные крольчата Культура ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма того же вида, что и ГММ 4.5.2. Сущность метода В каждый опыт берут не менее 3 крольчат. Животных фиксируют на специальном столе и внутримышечно во внутреннюю область бедра вводят тиопентал натрия (0,1 мл 1%-ного раствора на 50 г веса животного). Наркотический эффект наступает через 2 - 3 минуты. По средней линии живота крольчонка делают разрез брюшины по 1 см в обе стороны от пупка. Извлекают петли дистального отдела тонкого кишечника и в его просвет на расстоянии 3 - 5 см от уровня верхушки аппендикса, имеющего общую брыжейку с подвздошной кишкой, вводят с помощью иглы шприца (1,0 см3) 0,1 мл микробной взвеси, содержащей 108 КОЕ/см3. Одновременно делают 10-кратные разведения взвеси ГММ и из 3, 4 и 5-го разведений производят посевы по 0,5 мл на плотную питательную среду, делая параллельные высевы по 2 чашки Петри на каждое разведение. Через 1,5 часа после заражения животных усыпляют хлороформом и вскрывают. Отступя 5 - 7 см от слепой кишки, извлекают участок подвздошной кишки длиной 20 см и переносят в чашку Петри. Чтобы предупредить элиминацию ГММ со слизистой кишечника исследуемый материал помещают на лед и дальнейшие процедуры проводят оперативно. Отрезки кишечника разрезают вдоль, трижды промывают в охлажденном при 4 °С растворе 0,9%-ного хлористого натрия, растирают в ступке или специальном гомогенизаторе. К растертой ткани добавляют 1 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия, и полученные суспензии переносят в пробирки, и делают 10-кратные разведения. Из 3, 4, 5-го разведений делают посевы по 0,5 мл на плотную питательную среду, делая параллельные высевы по 2 чашки Петри на каждое разведение. Через 18 - 24 часа после инкубации при температуре, оптимальной для выращивания исследуемого вида ГММ, подсчитывают число выросших колоний, изолированных со слизистой тонкого кишечника и высеянных непосредственно из пробирки до заражения кроликов. Таким образом определяется число ГММ, прикрепившихся к слизистой тонкого кишечника. 4.5.3. Учет и интерпретация результатов Коэффициент адгезии для количественной оценки адгезивной активности ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма высчитывают по следующей формуле:  где: К - коэффициент адгезии - процент адгезивных ГММ в популяции исследуемого штамма; а - число жизнеспособных ГММ, введенных в кишечник крольчат; в - число ГММ, прикрепившихся к стенке кишечника. По степени адгезивности ГММ они оцениваются следующим образом: а) высокоадгезивные с коэффициентом адгезии 3,0 и выше, б) адгезивные - от 1 до 3 и в) слабоадгезивные - 0,001 - 0,9. Слабоадгезивные штаммы, как правило, авирулентны, а адгезивные и высокоадгезивные штаммы обычно обладают определенными вирулентными свойствами. Оценка ГММ осуществляется по двум показателям: 1) он должен иметь коэффициент адгезии не более чем 0,9 и 2) коэффициент адгезии ГММ должен быть равен или быть меньше коэффициента адгезии штамма-реципиента. При показателях коэффициента адгезии выше 1,0 требуются молекулярно-генетические исследования на выявление генов адгезии у ГММ и штамма-реципиента. 4.6. Определение инвазивности ГММ и штамма-реципиента Инвазивность грамотрицательных бактерий тестируют с помощью кератоконъюнктивальной пробы. Сущность метода заключается в том, что возбудитель проникает в эпителиальные (инвазирует их) клетки конъюнктивы, а затем в роговицу и размножается в них, вызывая очаговое, а затем и сплошное разрушение ткани. 4.6.1. Материалы и инструментарий
4.6.1.1. Животные и штаммы Морские свинки Культура ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма того же вида, что и ГММ Выращенные на селективной для данного вида микроорганизма плотной или жидкой питательной среде клетки ГММ и штамма-реципиента трижды отмывают в стерильной дистиллированной воде и готовят взвесь по стандарту McFarland или стандартам мутности ГИСК им. Тарасевича в концентрации 1 х 108 КОЕ/см3. 0,1 см3 приготовленной таким образом взвеси вносят в конъюнктиву глаза. Со второго дня после введения в течение 14 дней проводят визуальное исследование поражений конъюнктивы и роговицы глаза. У штаммов, обладающих низкой вирулентностью, поражения роговицы, носящие обратимый характер, наблюдаются в более поздние сроки. Контроль: отрицательный - 0,1 мл в конъюнктиву глаза стерильной дистиллированной воды; положительный - 0,1 мл в конъюнктиву глаза вирулентной культуры возбудителя дизентерии - S. flexneri или S. sonei. 4.6.2. Учет результатов ГММ, штамм-реципиент и контрольный (референтный) штамм того же вида, что и ГММ, не должны вызывать поражения конъюнктивы и роговицы. В случае выраженных инвазивных свойств выносится отрицательное заключение о возможности использования ГММ в производстве пищевых продуктов. 4.7. Определение антагонистической или симбиотической активности ГММ и штамма-реципиента с представителями резидентной микрофлоры кишечника человека Определение взаимодействия ГММ и штамма-реципиента с резидентной микрофлорой кишечника человека является обязательным для пробиотиков, а также микроорганизмов, входящих как компоненты пищевых продуктов (например, кисломолочная продукция). Для других представителей ГММ данное исследование выполняется по решению экспертного совета, выполняющего микробиологическую и молекулярно-генетическую оценку ГММ и штамма-реципиента. 4.7.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды 4.7.1.1. Аппаратура и инструментарий
4.7.1.2. Лабораторная посуда и материалы
4.7.1.3. Реактивы и питательные среды
_________________ * Производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные к использованию. Питательные среды:
4.7.1.4. Штаммы ГММ, штамм-реципиент, контрольный (референтный) штамм того же вида, что и ГММ Контрольные (референтные) штаммы, представляющие основные виды резидентной микрофлоры человека: Грамположительные облигатно-анаэробные бактерии Лактобактерии Бифидобактерии Пептострептококки Грамотрицательные облигатно-анаэробные бактерии Бактероиды Факультативно-анаэробные микроорганизмы Кишечная палочка Стафилококки Стрептококки Дрожжеподобные грибы рода Candida Контрольные штаммы, используемые в настоящем разделе, должны иметь паспортные данные и принадлежать к Американской типовой коллекции культур (АТСС) или получены из музея живых культур Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Допускается использование других разрешенных питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя. Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке. 4.7.2. Сущность метода Из выращенных на плотных или жидких питательных средах контрольных штаммов и ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма того же вида, что и ГММ, готовят взвеси микроорганизмов с определенными концентрациями КОЕ/мл. Далее готовят ряды пробирок с жидкой питательной средой по 3 мл, на которой способны расти все исследуемые микроорганизмы (например, триптиказо-соевый или L-бульон), и вносят по 0,5 мл 101, 103 и 105 КОЕ/см3 ГММ и такое же количество клеток контрольного штамма (например, Bifidobacterium). Одновременно осуществляют посевы на селективные питательные среды в разведениях для точного подсчета клеток каждого вида микроорганизма. Например, для точного подсчета количества клеток стафилококков посев осуществляется на желточно-солевой агар при дальнейшем культивировании при 37 °С в течение 48 часов в аэробных условиях, в то время как для определения количества клеток бифидобактерий взвесь микроорганизмов высевается на модифицированную среду Блоурока, а культивирование производят в анаэробных условиях при 37 °С в течение 48 часов. Через 6 и 24 часа осуществляют посевы на селективные питательные среды и подсчитывают число клеток представителя резидентной микрофлоры и ГММ. Контролями служат посевы, в которых выращивается только представитель резидентной микрофлоры или ГММ. Вычисляется число клеток представителя резидентной микрофлоры, выращенного в присутствии ГММ и отдельно. При приблизительно одинаковом соотношении числа выросших клеток отдельно и в присутствии ГММ можно считать, что ГММ не обладает антагонистическим действием. При более высоких показателях числа выросших клеток обоих видов, чем при выращивании каждого из представителей в отдельности, можно констатировать, что оба вида характеризуются симбиотическим действием. При превышении количества клеток представителя резидентной микрофлоры в 5 и более раз, выращенного без ГММ, чем в смеси с ГММ, можно полагать антагонистическое действие ГММ на конкретного представителя нормальной микрофлоры кишечника. В случае, если такое антагонистическое действие ГММ проявляется ко всем или большинству из исследованных представителей нормальной микрофлоры кишечника человека, делается заключение о невозможности его использования в производстве пищевых продуктов. При выявлении антагонистического действия ГММ к 1 - 2 представителям нормальной микрофлоры кишечника человека требуются дополнительные исследования, включающие исследование антагонистической активности ГММ и штамма-реципиента с представителями резидентной микрофлоры кишечника человека in vivo, молекулярно-генетические исследования по выявлению генов, детерминирующих данный феномен. |
Похожие:
 | Методические указания предназначены для студентов заочной формы обучения по специальности Техническое обслуживание и ремонт автомобильного... |  | Методические рекомендации печатаются по решению Методического Совета гбоу спо со «еэтк» |
| Номинация: «методические рекомендации по освоению учебной дисциплины, междисциплинарного курса, профессионального модуля» | | Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... |
| Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... | | Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... |
| Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... | | Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании пцк по укрупненной группе 140000 Электроснабжение (нпо и спо) |
| Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический... | | Методические указания к выполнению курсовых и дипломных проектов (работ) по специальности «Электромеханика». – Ростов н/Д: Рост гос... |