16. Крейнгольд С.У. и Шестаков К.А. Методика определения фосфида цинка в техническом препарате//Дезинфекционное дело, N 2. 2003. С. 23 - 24.
17. Хубер Л. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ. М.: Мир, 1993. 95 с.
18. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарате пенокумарин хроматографическими и спектрофотометрическими методами от 20.12.1976 N 1550-76//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочное. Мин. сельхоз. СССР. Гос. Комиссия по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками/Под ред. М.А. Клисенко. М.: Колос, 1983. С. 227 - 331.
19. Крейнгольд С.У. Простые и экспрессные методы химического контроля качества дезинфекционных препаратов//Дез. дело. N 4. 2002. С. 37 - 39.
20. Крейнгольд С.У. Спектрофотометрическое определение фенолов в дезинфицирующих средствах после разделения их методом тонкослойной хроматографии//Дез. дело, N 4. 2003. С 45 - 47.
21. Крейнгольд С.У. и Шестаков К.А. Определение триклозана в жидком туалетном антибактериальном мыле//Дез. дело, N 3. 2003. С. 46 - 47.
22. Мыло жидкое с дезинфицирующим эффектом "НИКА-СВЕЖЕСТЬ антибактериальное". ТУ 9392-023-12910434-2005. ООО НПФ "ГЕНИКС".
23. Средство дезинфицирующее "ДЕЛАСЕПТ-ГЕЛЬ" (кожный антисептик). Технические условия ТУ 9392-051-00479095-2005. ЗАО "Петроспирт".
24. Средство дезинфицирующее КЕМИ-САЙД. Технические условия ТУ 9392-001-5671Б5159-2004. ООО "КЕМИТРЕЙД".
5. Микробиологические методы исследований и критерии оценки
эффективности дезинфицирующих и стерилизующих средств
Общие положения
Современные дезинфицирующие средства ДС представляют собой индивидуальные химические соединения или композиционные составы, включающие одно или несколько действующих веществ ДВ. Кроме того, в их состав могут входить вспомогательные компоненты: стабилизаторы, ингибиторы коррозии, моющие вещества, красители, отдушки и др.
В качестве действующих веществ в ДС используют хлорактивные, кислородактивные соединения, альдегиды, четвертичные аммониевые соединения, амины, гуанидины; спирты и др.
ДС производятся в форме жидких концентратов, готовых к применению жидкостей, порошков, таблеток, гелей, спреев, салфеток, биоцидных лакокрасочных материалов и др.
ДС должны отвечать следующим требованиям [14, 21, 23, 51, 66]:
- обладать достаточной антимикробной активностью в отношении патогенных и условно патогенных видов микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов, а также споровых форм микроорганизмов;
- относительно низкой токсичностью для человека;
- быть экологически безопасными;
- быть стабильными при хранении;
- не иметь резкого неприятного запаха;
- хорошо растворяться в воде;
- не повреждать обрабатываемые объекты;
- иметь оптимальное соотношение стоимость-качество.
К некоторым средствам узкоцелевого назначения дополнительно предъявляют индивидуальные требования, изложенные в соответствующих главах.
ДС могут быть универсального назначения, которые рекомендуется применять для дезинфекции многих объектов при разных инфекциях, или узко целевого назначения, предназначенные для дезинфекции одного конкретного объекта, например для дезинфекции стоматологических оттисков, или воздуха, или поверхностей и т.д.
Предполагаемая сфера применения ДС определяет объем микробиологических исследований, необходимых для разработки режимов обеззараживания соответствующих объектов.
Микробиологические исследования начинают только после получения результатов химико-аналитических исследований, подтверждающих соответствие средства требованиям нормативно-технической документации НТД: технических условий - на отечественные средства, спецификации - на зарубежные.
Этапы исследований дезинфицирующих веществ и дезинфицирующих средств. Микробиологические исследования включают изучение активности ДВ и изучение эффективности ДС [51, 52, 66].
При исследовании субстанций, предназначенных для производства ДС, определяют спектр антимикробного действия в экспериментах in vitro.
Исследование свойств ДС проводят в 3 этапа:
1) определение in vitro спектра антимикробной активности ДС и влияния на нее различных факторов: pH, органических веществ, температуры;
2) эффективность обеззараживания искусственно контаминированных тест-микроорганизмами объектов в лабораторных условиях с целью разработки режимов применения ДС в зависимости от концентрации ДВ, времени воздействия, характера объекта, способа обработки и других факторов;
3) испытание ДС в практических условиях для подтверждения эффективности разработанных режимов в реальных условиях применения в случаях: исследования средства, содержащего новое ДВ; нового способа применения, значительного снижения концентрации и времени воздействия по сравнению с ранее разрешенными режимами и пр.
5.1. Методы изучения и оценки бактерицидной активности
дезинфицирующих средств и их субстанций
5.1.1. Тест-микроорганизмы для изучения
бактерицидной активности ДС и их субстанций.
Требования к тест-микроорганизмам
При изучении бактерицидной активности дезинфицирующих субстанций и ДС в качестве тест-микроорганизмов используют [66]: Escherichia coli (штамм 1257), Pseudomonas aeruginosa (штамм АТСС 27853), Salmonella typhimurium - для оценки бактерицидной активности в отношении грамотрицательных бактерий; Staphylococcus aureus (штамм 906) - для оценки бактерицидной активности в отношении грамположительных бактерий.
При сертификационных испытаниях и экспертной оценке ранее зарегистрированных ДС набор тест-микроорганизмов может быть ограничен наиболее устойчивыми представителями каждой группы.
Перечень тест-микроорганизмов, если он шире стандартного, указан в соответствующих разделах по изучению эффективности ДС при обеззараживании отдельных объектов.
Условия культивирования тест-микроорганизмов. Тест-микроорганизмы - E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa и S. aureus - культивируют на следующих питательных средах: казеиновом бульоне, мясо-пептонном бульоне, агаре Эндо, казеиновом агаре, мясо-пептонном агаре и т.п. при температуре 37 °C в течение 18 - 24 ч.
Музейные культуры указанных выше микроорганизмов хранят при температуре плюс (3 +/- 1) °C в ампулах (после лиофильной сушки) или на плотных питательных средах (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5 - 3 мм), а рабочие культуры - на скошенном агаре или в бульоне.
Тест-микроорганизмы должны иметь типичные биохимические, морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, присущие данному виду [66], и обладать стандартной устойчивостью к эталонным дезинфицирующим средствам: растворам хлорамина, перекиси водорода, катамина АБ - алкилдиметилбензиламмония хлорида АДБАXg, глутарового альдегида (табл. 5.1).
Таблица 5.1
УСТОЙЧИВОСТЬ ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМОВ К ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИМ АГЕНТАМ
Дезинфицирующее
вещество
|
Концентрация
раствора
по ДВ, %
|
Время гибели тест-микроорганизмов,
мин., не менее
|
Е. coli, шт. 1257
|
S. aureus, шт. 906
|
Хлорамин
|
0,020 <*>
|
5
|
-
|
0,200 <*>
|
-
|
15
|
АДБАХ
|
0,025
|
20
|
10
|
Глутаровый альдегид
|
0,030
|
10
|
-
|
0,060
|
-
|
10
|
Перекись водорода
|
2,000
|
10
|
-
|
3,000
|
-
|
25
|
<*> Концентрация раствора указана по препарату.
|
Устойчивость тест-микроорганизмов к эталонным дезинфицирующим средствам определяют методом батистовых тест-объектов (п. 5.1.2.2).
Проверку устойчивости тест-микроорганизмов проводят не реже 1 раза в месяц. При снижении резистентности культур делают их пересевы на обогащенные питательные среды до восстановления устойчивости.
5.1.1.1. Методы приготовления суспензии
тест-микроорганизмов. Определение биологической
концентрации тест-микроорганизмов в бактериальной суспензии
Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием тест-культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур, окрашенных по Грамму.
Рабочую суспензию тест-культур готовят из культуры данного тест-штамма,
выращенного на плотной питательной среде (МПА или казеиновый агар) при
температуре 37 °C в течение 18 - 24 ч. Для приготовления бактериальной
взвеси культуру смывают с агара стерильной питьевой водой. Полученную
взвесь микробов фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разводят стерильной
питьевой водой до концентрации, соответствующей по мутности оптическому
стандарту мутности (ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.
9
Л.А. Тарасевича" Роспотребнадзора) N 20 (он соответствует 2 x 10 микробных
тел в 1 мл).
В связи с тем, что суспензия может содержать наряду с живыми мертвые микроорганизмы, необходимо определять бактериологическую концентрацию фактического количества живых клеток в приготовленной суспензии, чтобы при необходимости внести коррективы и обеспечить требуемые уровни контаминации батистовых тест-объектов жизнеспособными микроорганизмами.
Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов выполняют методом последовательных десятикратных разведений суспензии тест-микроорганизма в стерильной питьевой воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (казеиновый агар, агар Эндо, МПА). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре проводят подсчет выросших колониеобразующих единиц КОЕ и определяют количество жизнеспособных бактерий в одном мл суспензии.
Из практики известно, что суспензия, содержащая такое количество живых
микробов, при контаминации ею батистовых тест-объектов обеспечивает
5 6
требуемые (порядка 1 x 10 - 1 x 10 КОЕ/кв. см) уровни их обсеменения
живыми клетками тест-микроба.
5.1.1.2. Приготовление рабочих растворов ДС и их субстанций
Рабочие растворы ДС и их субстанций готовят непосредственно перед проведением исследований (кроме тех случаев, когда изучают стабильность рабочих растворов в процессе хранения).
При изучении средств, производимых в форме гранул, порошков, таблеток и т.п., рабочие растворы используют только после полного растворения ДВ дезинфицирующего средства (если не указано на возможность выпадения осадка).
Для оценки антимикробного действия субстанций и ДС в лабораторных условиях и исследования эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов, растворы готовят на стерильной питьевой воде. Для этого необходимое количество сухого ДС или жидкого концентрата вносят в пробирку, колбу и добавляют расчетное количество воды, тщательно размешивают и закрывают пробкой. Отмечают время полного растворения и внешний вид приготовленного рабочего раствора.
Температура растворов ДС должна быть в пределах плюс (20 +/- 2) °C (если по условиям эксперимента не рекомендована другая температура) независимо от температуры окружающей среды. Для поддержания требуемой температуры используют водяную баню.
При испытании ДС в практических условиях рабочие растворы готовят на нестерильной питьевой воде комнатной температуры (20 +/- 2) °C или при необходимости - умеренно повышенной температуры 45 - 50 °C. Навеску средства или отмеренное количество жидкого концентрата вносят в соответствующую емкость, добавляют воду, размешивают и закрывают крышкой. Работу с раствором начинают после полного растворения ДВ. Рабочие растворы из ДС в форме таблеток готовят путем добавления в отмеренный объем воды определенного числа таблеток.
Рабочие растворы субстанций и ДС готовят с соблюдением мер предосторожности. Если ДВ относится к летучим веществам и представляет опасность при ингаляционном воздействии, растворы готовят в вытяжном шкафу или в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией, в респираторе РУ 60М или РПГ-67, кожу рук защищают резиновыми перчатками, глаза - защитными очками.
Исследуемые ДС (перед, во время и после исследований) следует хранить в соответствии с требованиями технических условий или спецификации; при отсутствии таковых - в соответствии с СП 3.5.1378-03 [14].
5.1.2. Методы исследований и оценки результатов
бактерицидной активности ДС и их субстанций in vitro
Целью исследований является определение уровня и спектра антимикробной активности ДС и их субстанций.
Субстанции, предназначенные для производства ДС, должны соответствовать следующим требованиям:
- хорошо растворяться в воде или других растворителях;
- обладать бактерицидной активностью, т.е. убивать бактерии, а не задерживать их рост;
- иметь удовлетворительные органолептические (по цвету, запаху) и физико-химические (по растворимости, биоразлагаемости и стабильности при хранении и др.) свойства.
Антимикробную активность ДС и их субстанций изучают суспензионным методом или методом батистовых тест-объектов.
5.1.2.1. Суспензионный метод
Для приготовления растворов ДС в различных концентрациях ДВ разводят
или растворяют в стерильной питьевой воде, далее по 4,5 мл разливают в
стерильные пробирки, в которые добавляют 0,5 мл взвеси тест-микроорганизма
9
или бульонной культуры, содержащей 1 x 10 к/мл, и тщательно перемешивают.
Через определенные интервалы времени (5 мин.) по 0,5 мл взвеси
"тест-микроорганизм + ДВ" добавляют к 4,5 мл соответствующего
нейтрализатора, снова тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем по
0,5 мл вносят в пробирку с 4,5 мл стерильной питьевой воды, после чего
0,1 мл из этой пробы вносят в пробирки с 5 мл жидкой и на поверхность
твердой питательной среды. В контрольных опытах вместо растворов ДС
используют стерильную питьевую воду, а посевы делают в среду без
нейтрализации или с нейтрализацией.
Температура инкубирования посевов в термостате - 37 °C, сроки учета результатов опыта - 24 - 48 ч. Для подтверждения снятия биоцидного действия ДВ из пробирок, в которых отсутствовал рост тест-культуры, ежедневно делают пересев по 0,5 мл в 4,5 мл новой питательной среды.
|
