4.4.3.3. Хроматографические методы определения
антикоагулянтов индандионового ряда
Определение антикоагулянтов индан-1,3-дионового ряда (дифенацин, изопропилфенацин, хлорфасинон, этилфенацин) в субстанциях (технические продукты, жидкие и порошковые концентраты) и различных препаративных формах дератизационных средств проводят методом прямой или обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии с применением спектрофотометрического детектирования. Для идентификации и хроматографических измерений антикоагулянтов индан-1,3-дионового ряда применяют спектрофотометрические детекторы на диодной матрице для измерений в области 190 - 400 нм и детекторы для измерений при одной длине волны. Надежность идентификации ДВ, характеризующихся близкими спектрами поглощения в ультрафиолетовой области, достигается использованием двух критериев: 1) спектр поглощения в области 190 - 400 нм; 2) время удерживания в заданных условиях хроматографических измерений.
При анализе технических продуктов (трифенацин, тетрафенацин), представляющих собой малоочищенную технологическую смесь, в которой содержится несколько индандионов с разным содержанием, применение диодно-матричного детектора позволяет записать спектры поглощения каждого пика хроматограммы в диапазоне 190 - 400 нм и идентифицировать индандионы по спектрам поглощения в рабочей градуировочной смеси и испытуемой пробе.
Специфические условия подготовки пробы для анализа обуславливаются содержанием действующего вещества и свойствами ингредиентов рецептуры средства (технологические и функциональные добавки, в т.ч. натуральные пищевые аттрактанты).
Технические продукты и жидкие концентраты растворяют в растворителе, совместимом с хроматографической подвижной фазой. Из порошковых концентратов и пищевых приманок требуется выделение действующего вещества в органическую фазу с помощью экстракции. При этом из-за низкого уровня содержания ДВ в пищевых приманках на фоне сложного рецептурного состава и пищевой основы повышаются требования к селективному выделению действующего вещества и условиям эффективного хроматографического разделения компонентов пробы.
Хроматографический метод определения индандионов с применением прямофазной высокоэффективной хроматографии основан на применении УФ-детектирования, хроматографировании пробы на аминной колонке в изократическом режиме с использованием абсолютной градуировки. В качестве элюента (подвижной фазы) применяют смесь ацетонитрил:вода в соотношении 80:20 по объему.
Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии нескольких ДВ индан-1,3-дионового ряда. Определению не мешают технологические примеси в техническом продукте.
Приборы. Аналитический жидкостный хроматограф "Стайер" или другого типа, снабженный спектрофотометрическим детектором на диодной матрице или детектором для измерений при одной длине волны в ультрафиолетовой области спектра, термостатируемой колонкой, изократической системой микронасосов, инжектором типа "Реодайн" (или другого типа) с дозирующей петлей объемом от 5 до 20 мкл, программой управления оборудованием и обработки хроматографических данных на базе персонального компьютера; хроматографическая колонка, как правило, заводского заполнения сорбентом, с соответствующей предколонкой; микрошприц вместимостью 100 - 250 мкл для ручного ввода пробы в инжектор и промывки инжектора; фильтрующее устройство с фильтром 0,45 мкм; ультразвуковая ванна для дегазации элюентов и подготовки пробы; общелабораторное оборудование (аналитические весы с точностью взвешивания до 0,1 мг; мерная стеклянная посуда).
Реактивы и растворы. Ацетонитрил градации для жидкостной хроматографии
(210 - 230 нм), вода бидистиллированная или очистки супер-q на оборудовании
"Миллипор". Подвижная фаза (элюент) - ацетонитрил:вода (80:20 по объему),
дегазированная перед использованием с помощью ультразвуковой ванны или
потока гелия. Сорбенты для прямофазной хроматографии типа сепарон SGX NH ,
2
лихросорб NH .
2
Выполнение анализа. Точную навеску технического продукта около
0,05 - 0,1 г (0,5 - 0,7 г жидкого концентрата) или аналитического стандарта
определяемого вещества помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и
растворяют в 5 - 7 мл хлороформа, затем проводят разбавление
приготовленного раствора элюентом (из расчета получения концентрации в
рабочей градуировочной смеси и испытуемом растворе 0,010 - 0,005 мг/мл) и
4 мкл приготовленного раствора вводят в хроматограф. Условия
хроматографирования: колонка типа сепарон SGX NH 5 мкм (150 x 3,3 мм);
2
скорость элюента - 0,4 мл/мин.; температура колонки 60 °C.
Спектрофотометрические измерения проводят при длине волны 288 нм.
Из полученных хроматограмм рабочей градуировочной смеси определяют время удерживания и площадь хроматографического пика определяемого вещества в рабочей градуировочной смеси. По совладению времени удерживания на хроматограммах градуировочной смеси и хроматограммах анализируемой пробы проводят идентификацию веществ и вычисляют площади их хроматографических пиков в пробе.
Обработка результатов. Вычисление массовой доли ДВ в средстве X в процентах с применением абсолютной градуировки проводится по формуле:
S x C x a x V x k
гс
X = -------------------,
S x m
гс
где:
S и S - площади хроматографических пиков определяемого вещества в
гс
испытуемой пробе и рабочей градуировочной смеси;
C - массовая концентрация аналитического стандарта определяемого
гс
вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;
a - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;
V - объем раствора пробы, мл;
k - кратность разведения раствора пробы;
m - масса анализируемой пробы, мг.
В отсутствие стандартных образцов определяемых веществ при анализе дератизационных субстанций в виде малоочищенной технологической смеси (трифенацин, тетрафенацин) в качестве аналитического стандарта может быть принят стандарт дифенацина, имеющий квалификацию государственного стандартного образца. Массовую долю ДВ вычисляют по сумме площадей всех хроматографических пиков, характеризующихся спектрами индан-1,3-дионов.
При вычислении содержания примесей в техническом продукте может быть применен метод нормализации площадей.
Хроматографический метод определения индандионов с применением обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии основан на применении УФ-детектирования, хроматографировании пробы в градиентном режиме и использовании абсолютной градуировки.
Хроматографирование проводят на колонках, заполненных сорбентом типа сепарон C18, ультрасфер ODS, партисил ODS 2; в качестве элюента используют смеси растворителей, приготавливаемые по объему: метанол:изопропанол:0,1%-ный раствор фосфорной кислоты в соотношении 65:15:20, ацетонитрил:0,2%-ный раствор фосфорной кислоты в соотношении 75:25, а также применяют другие хроматографические системы сорбент-элюент для обращенно-фазной хроматографии.
Метод избирателен. Спектрофотометрическому измерению дифенацина, этилфенацина, изопропилфенацина и хлорфасинона не мешают технологические и функциональные добавки, типичные для рецептурного состава приманок: битрекс, бензоат натрия, красители. В зависимости от состава пищевой основы экспериментально подбирают условия экстракционного выделения ДВ и очистки экстракта с помощью тест-пробы.
Выполнение анализа.
Подготовка пробы. В навеску зерновой приманки массой 10 - 20 г добавляют 100 мл органического растворителя и проводят экстрагирование с помощью ультразвуковой ванны в течение 30 - 50 мин. В качестве экстрагента может быть применен ацетонитрил; ацетонитрил, подкисленный уксусной кислотой (1% об.); ацетонитрил:метанол в соотношении 1:1 и др. После отстаивания отбирают аликвоту экстракта, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют в градиентном режиме обращенно-фазной хроматографии.
При анализе зерновой приманки в виде парафинированного брикета может быть использована последовательная экстракция растворителями разной полярности. Сначала проводят экстракцию небольшими порциями гексана при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Экстракцию повторяют несколько раз, проэкстрагированный гексаном образец подсушивают до воздушно-сухого состояния, после чего проводят экстракцию ацетонитрилом с помощью ультразвуковой ванны в течение 30 мин. В гексановый экстракт добавляют сорбент - оксид алюминия и после выдерживания в течение 20 - 30 мин. фильтруют. Осадок на фильтре промывают ацетонитрилом, полученный фильтрат вносят в подсушенный образец и проводят экстракцию ацетонитрилом с помощью ультразвуковой ванны в течение 30 мин. После отстаивания отбирают аликвоту экстракта, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют в градиентном режиме обращенно-фазной хроматографии.
Условия хроматографирования: колонка типа LUNA C18 3 мкм (150 x 3,3 мм); элюент А - ацетонитрил; элюент Б - 0,16%-ный раствор фосфорной кислоты. Градиент по ацетонитрилу от 60 до 85% за 10 мин.; скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин; температура колонки комнатная; объем хроматографируемой дозы 10 мкл. Примерное время удерживания хлорфасинона 8,9 мин., дифенацина 10,2 мин.
Идентификацию определяемого вещества проводят сравнением времени удерживания в градуировочной смеси и анализируемой пробе при одной длине волны в интервале 250 - 280 нм, дополнительно могут быть использованы спектры поглощения в области 190 - 400 нм в исследуемой пробе и градуировочной смеси.
Обработка результатов. Массовую долю ДВ в приманке X в процентах с применением абсолютной градуировки вычисляют с учетом фактора извлечения тета по формуле:
S x C x a x V x k
гс
X = -------------------,
S x m x тета
гс
где:
S и S - площади хроматографических пиков определяемого вещества в
гс
испытуемой пробе и рабочей градуировочной смеси;
C - массовая концентрация аналитического стандарта определяемого
гс
вещества в рабочей градуировочной смеси, мг/мл;
a - массовая доля основного вещества в аналитическом стандарте, %;
V - объем раствора пробы, мл;
k - кратность разведения раствора пробы;
m - масса анализируемой пробы, мг;
тета - фактор извлечения устанавливают по контрольному образцу с
известным содержанием определяемого вещества, тета = m / m .
контр
4.4.4. Методы определения антикоагулянтов кумаринового ряда
4.4.4.1. Спектрофотометрические методы определения
зоокумарина и бромадиолона
Определение зоокумарина и бромадиолона в дератизационных средствах спектрофотометрическим методом может быть проведено по собственному поглощению в ультрафиолетовой части спектра и по измерению оптической плотности растворов натриевой соли.
Спектрофотометрический метод определения зоокумарина и бромадиолона по собственному поглощению в ультрафиолетовой части спектра основан на измерении оптической плотности раствора пробы в органическом растворителе с использованием молярного коэффициента поглощения определяемого вещества.
Приборы, реактивы и растворы. Спектрофотометр СФ-26 или другого типа; весы аналитические; ротационный испаритель; стеклянная мерная посуда; 2%-ный раствор натрия гидроокиси; хлороформ; диоксан; этанол; оксид алюминия для хроматографии.
Выполнение анализа. Зоокумарин (3%) из навески порошкового средства массой около 0,1 г экстрагируют 25 мл диоксана с помощью магнитной мешалки и разбавляют диоксаном в 10 раз, после фильтрования проводят измерение оптической плотности раствора при длине волны 310 нм.
Обработка результатов. Содержание зоокумарина в средстве X в процентах вычисляют по формуле:
D - D x 308,2 x V x 10 x 100
0
X = -----------------------------,
эпсилон x m x l
где:
D и D - оптические плотности анализируемого раствора и раствора
0
"холостой" пробы средства, не содержащей зоокумарина;
308,2 - молекулярная масса зоокумарина, г/моль;
V - объем фотометрируемого раствора, мл;
10 - кратность разведения экстракта;
тета - молярный коэффициент поглощения зоокумарина в диоксане, равный 14500 л/моль x см;
m - масса средства, г;
l - толщина поглощающего слоя, см.
При определении бромадиолона (0,25%) в концентрате навеску средства массой около 0,04 г растворяют в 5 мл этанола. Измерения проводят при длинах волн 320 и 340 км. При вычислении содержания бромадиолона применяют разность молярных коэффициентов поглощения бромадиолона при 320 и 340 нм, равную 7800 л/моль x см.
Метод не избирателен в присутствии растворимых веществ рецептурного состава средства, поглощающих в указанных областях спектра. Метод может быть применен для серийных анализов в условиях производства.
Спектрофотометрический метод определения зоокумарина по поглощению его натриевой соли основан на измерении при 306 - 308 нм оптической плотности раствора натриевой соли зоокумарина, получаемой с помощью 2%-ного раствора гидроокиси натрия.
Метод не избирателен в присутствии веществ в пробе, поглощающих при длине волны измерения 306 - 308 нм. Метод может быть применен для серийных анализов в условиях производства.
Выполнение анализа. При анализе технического продукта пробу растворяют в 2%-м растворе гидроокиси натрия и измеряют оптическую плотность при 306 - 308 нм.
При анализе препаративных форм проводят извлечение хлороформом, при необходимости - сорбционную очистку экстракта на колонке с окисью алюминия. Растворитель отгоняют и растворяют сухой остаток в 2%-м растворе гидроокиси натрия. После фильтрования измеряют оптическую плотность при 308 нм, используя в качестве раствора сравнения "холостую пробу". Количество ДВ измеряют по калибровочному графику в интервале 25, 50, 100 и 200 мкг, для построения которого применяют стандартный раствор натриевой соли зоокумарина 0,1 мг/мл.
Обработка результатов. Массовую долю зоокумарина в средстве X в процентах вычисляют по формуле:
C x V
X = ------------ x 100,
6
V x m x 10
1
где:
C - содержание зоокумарина, найденное по калибровочному графику, мкг;
V - объем раствора средства, мл;
V - объем раствора, взятый для анализа, мл;
1
m - масса средства, взятая для анализа, г;
6
10 - коэффициент пересчета мкг в г.
4.4.4.2. Хроматографические методы определения
антикоагулянтов оксикумаринового ряда
Определение антикоагулянтов кумаринового ряда (бродифакума, бромадиолона, дифетиалона, зоокумарина, куматетралила, флокумафена) в субстанциях (технических продуктах, жидких и порошковых концентратах) и различных препаративных формах дератизационных средств проводят методом прямой или обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии с применением спектрофотометрического детектирования. Для идентификации и хроматографических измерений антикоагулянтов оксикумаринового ряда применяют спектрофотометрические детекторы для измерений при одной длине волны, а также детекторы на диодной матрице для измерений в области 190 - 400 нм, которые позволяют повысить надежность идентификации веществ за счет использования двух критериев: 1) спектр поглощения в области 190 - 400 нм; 2) время удерживания в заданных условиях хроматографических измерений.
Специфические условия подготовки пробы и спектрофотометрического детектирования обуславливаются содержанием ДВ и составом ингредиентов рецептуры средства (технологические и функциональные добавки, в т.ч. натуральные пищевые аттрактанты).
Субстанции (технические продукты и жидкие концентраты) растворяют в растворителе, совместимом с хроматографической подвижной фазой. Определение ДВ проводят в условиях прямой или обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии. При анализе технического продукта определяют содержание основного вещества с использованием абсолютной градуировки или "внутреннего эталона", для количественной оценки примесей применяют метод нормализации площадей.
|
