Методические указания для самостоятельной работы студентов Лабораторное занятие №1 тема: Микробиология, вирусология как наука. Устройство бактериологических и вирусологических лабораторий. Основные формы бактерий. Простые методы окраски
Скачать 1.96 Mb.
|
| ТЕМА: Основы вирусологии. Морфология вирусов и бактериофагов. Способы их выявления. МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ Вирусы – микроорганизмы исключительно малых размеров, которые не имеют клеточного строения, имеют в своем составе только один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) и которые не могут репродуцироваться вне живой клетки. Вирусология тесно связана с другими биологическими науками – биохимией, генетикой, химией, гистологией, фармакологией и др. ЦЕЛЬ: Сформировать у студентов представление о вирусологии как науке, об особенностях химического состава, морфологии, ультраструктуры вирусов и бактериофагов. ФОРМИРУЕМЫЕ КОМПЕТЕНЦИИ: Способность и готовность анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК-1); Способность и готовность выявлять естественнонаучную сущность проблем, возникающих в ходе профессиональной деятельности, использовать для их решения соответствующий физико-химический и математический аппарат (ПК-2); СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ: историю вирусологии, морфологию и ультраструктуру простых и сложных вирусов и бактериофагов, а также этапы их взаимодействия с клеткой. Знать методы изучения их структуры. СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ: различать вирусы человека и животных от вирусов бактерий. СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ: методами изучения морфологии вирусов. Вопросы, изученные на предшествующих дисциплинах и необходимые для освоения темы.
СОДЕРЖАНИЕ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ В УЧЕБНОЕ ВРЕМЯ: 1.По таблицам ознакомиться с особенностями морфологии простых и сложных вирусов. Зарисовать. 2. По таблицам ознакомиться с особенностями морфологии вирусов бактерий. Зарисовать. 3. Зарисовать таблицу: Этапы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина 4.Ознакомиться с методами качественной индикации вирусов (демонстрация). Оценить реакцию цветной пробы, реакцию гемагглютинации, реакцию бляшкообразования. Сделать выводы. Зарисовать. 5. Изучить особенности цитопатического действия вирусов (УПД). Зарисовать по таблицам. Репродукция вируса и его выход из клеток сопровождаются дегенерацией последних. Цитопатическое действие наиболее выражено при размножении вирусов в монослое, выражается в частичной гибели и деструкции монослоя. Получение клеточных культур:
Клетки наращивают до монослоя или высевают с нужной плотностью из трипсинизированной культуры за сутки до использования. Индикация вируса по его цитопатическому действию. С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральнуго жидкость, затем вносят но 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду (поддерживающую, без сыворотки) до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37°С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более). Дегенеративные изменения клеточного слоя не менее, чем на два креста ("++") при отсутствии таковых в незараженной культуре указывают на наличие в исследуемом материале вируса. Родственные вирусы обычно дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдаленных по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД нередко можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус. Так, для энтеровирусов (вирусы полиомиелита, Коксаки, ECHO) характерно ЦПД в виде однородной мелкозернистой деструкции клеток, клетки приобретают округленную форму, располагаются довольно равномерно. Для ЦПД аденовирусов типичным является превращение клеточного слоя в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда. Парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита дают цитопатический эффект в виде образования симплаотов. Титрование вирусов по цитопатическому действию. Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры (берут по 4 пробирки на каждое разведение). В остальном методика титрования вируса по ЦПД не отличается от вышеприведенной методики обнаружения вируса по ЦПД. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур. Титр вируса вычисляется по методу Рида и Менча. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД5о) в 1 мл. За одну ППД5о принимают O,1 мл вируссодержащего материала, разведенного до титра.
6. Изучить методы количественной оценки вирусов бактерий в исследуемом материале. Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах (по методу Отто) 1,5% МПА разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие колоний бактериофага). После застудневания МПА засевают 16—18-часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста посев растирают шпателем. Спустя 5—10 мин после посева на подсушенную поверхность каплями наносят исследуемый фильтрат. Чашки ставят в термостат на 18—24 часа при температуре 37°С. Учет результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом месте мелких стерильных пятен-колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности). Техника фаготипирования микробов по методу Креджи и Иенсена В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса определяет типовую принадлежность бактерий. Для фаготипирования бактерий применяют 1,5% МПА с 5% глицерина. Пророщенную бульонную культуру каплями наносят на поверхность питательной среды. Капли не должны растекаться. Они должны впитаться в течение 3—10 мин. Затем на поверхность каждой капли наносят по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага (для контроля роста культуры). Чашки помещают в термостат при температуре 37°С: через 6—8 часов производят учет результатов фаготипирования. Наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов указывает на принадлежность культуры к данному фаготипу.  ЗАДАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ УРОВНЯ СФОРМИРОВАННОСТИ КОМПЕТЕНЦИЙ В УЧЕБНОЕ ВРЕМЯ 1.Произвести посев исследуемой культуры на плотную питательную среду и определить чувствительность к бактериофагу методом «дорожки» Примеры тестовых заданий 1.ПОРЯДОК РАСПОЛОЖЕНИЯ КАПСОМЕРОВ У ВИРУСОВ НАЗЫВАЕТСЯ
2. ГЕНОМ ВИРУСА ВСТРОЕННЫЙ ВНУТРЬ КЛЕТОЧНОГО НАЗЫВАЕТСЯ: 1)линейным 2)кольцевым 3)провирусным 4)фрагментарным 3. ПЕРВООТКРЫВАТЕЛЕМ ВИРУСОВ СЧИТАЕТСЯ
4.ВЕЛИЧИНУ ВИРУСОВ ВЫРАЖАЮТ В
5.ПРОНИКНОВЕНИЕ ВИРУСА В КЛЕТКУ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ПУТЕМ 1) адсорбции 2) рецепторного эндоцитоза 3) воздействия клеточных липаз 4) активного транспорта ЛИТЕРАТУРА. Основная:
Дополнительная:
ФГБОУ ВО АМУРСКАЯ ГМА МИНЗДРАВА РОССИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ Методические указания для самостоятельной работы студентов по дисциплине «Микробиология, вирусология» Педиатрический факультет Лабораторное занятие №10 ТЕМА: Методы культивирования вирусов. Индикация и идентификация вирусов. МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ Вирусология является базой для развития эпизоотологии и некоторых других наук. Вирусы являются уникальными объектами для изучения нуклеиновых кислот и других вопросов генетики. За последние годы изучены многие свойства вирусов, предложены новые методы диагностики – ИФА, ПЦР, метод ДНК-зондов ЦЕЛЬ: Изучить методы культивирования вирусов и методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний человека. ФОРМИРУЕМЫЕ КОМПЕТЕНЦИИ: Способность и готовность анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК-1) Способность и готовность выявлять естественнонаучную сущность проблем, возникающих в ходе профессиональной деятельности, использовать для их решения соответствующий физико-химический и математический аппарат (ПК-2); СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ: правила забора материала для вирусологического исследования, основные методы культивирования и диагностики вирусных заболеваний человека, способы индикации и идентификации вирусов. СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ: Забирать материал для вирусологического исследования, проводить заражение куриного эмбриона, выявлять наличие вируса и идентифицировать его. СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ: методами оценки реакций идентификации вирусов и степени патогенности бактерий Вопросы, изученные на предшествующих дисциплинах и необходимые для освоения темы. 1. Антигенная структура вирусов 2. Мезанизмы иммунологических реакций СОДЕРЖАНИЕ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ В УЧЕБНОЕ ВРЕМЯ: 1. Уточнить способы заражения животных вируссодержащим материалом, записать в тетрадь протоколов. 2. Ознакомиться по таблицам с методом культуры клеток (зарисовать тельца Пашена). 3. Просмотреть куриный эмбрион с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона, провести его инфицирование вируссодержащим материалом. 4. Зарисовать по таблице морфологию куриного эмбриона, указать стрелками способы его заражения. 5. Оценить реакцию гемагглютинации (демонстрация). 6. Дать оценку РПГА (демонстрация), сделать вывод. 7. Дать оценку РТГА, ИФА, написать заключение. 8. Изучить методы экспресс-диагностики вирусных инфекций. 9. Описать в протоколах раздельно методы индикации и идентификации вирусов. • Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и др. Заражение в мозг (метод применяют при работе с нейротропными вирусами). Для заражения чаще используют белых мышей. Левой рукой плотно прижимают мышь к столу, большим и указательными пальцами оттягивают кожу головы назад. Туберкулиновым шприцем с предохранительной муфтой на игле, прокалывают лобную кость, несколько латеральное средней линии и вводят 0,03-0,02 мл материала. Игла вводится на глубину 1,5-2 мм, при этом ощущается чувство провала в полость черепа. Вытекающую жидкость удаляют сухим ватным тампоном без дезинфицирующих средств. Кроме животных для культивирования вирусов используют куриные эмбрионы и культуры клеток различных тканей. 1. Культуры клеток - это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др., а также культуры тканей опухолей). Культивирование клеток может производиться в специальных флаконах, колбах-матрацах и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь опору, например стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками. О наличии и размножении вируса в клетках узнают по цитопатическому эффекту. В результате размножения вируса, клетки культуры гибнут и под микроскопом видны их дегенеративные изменения. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки флакона или пробирки, рН среды мало изменяется по сравнению с контролем. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199,солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактатальбумина и др.). В настоящее время имеется много стабильных штаммов клеточных культур, пассируемых вне организма в течение многих лет. Это перевиваемые культуры тканей, штаммы клеток полученные из злокачественных опухолей и из нормальных тканей человека и животных. Они используются только для диагностики вирусных заболеваний. Для поддержания роста клеток пересев делают через 6-10 дней. Количество клеток за это время увеличивается в 4-10 раз. При пересеве для отслаивания культуры от стенок флакона используют 0,02% раствор версена (можно использовать раствор трипсина), предварительно из флакона удаляют питательную среду, затем вносят 0,5 мл раствора версена. Сосуды помещают в термостат на 20-30 мин, после чего встряхивают. Взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин 5-10 мин, клетки ресуспендируют в питательной среде. Подсчитывают в камере Горяева концентрацию клеток и разводят до 200000 клеток в 1 мл. 2. Цитопатогенное действие вируса на клетки проявляется при натуральной оспе- тельца Пашена, при бешенстве - тельца Негри и др. Элементарные тельца вируса оспы в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета. Внутриклеточные включения при бешенстве обнаруживаются в нервных клетках аммонова рога и клетках Пуркинье мозжечка. В препарате, окрашенном по Теревичу цитоплазма и ядра нервных клеток окрашены в желто-зеленый цвет. Тельца Негри расположены в цитоплазме и окрашены в малиново-красный цвет. 3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона: в хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, желточный мешок. Для заражения используют 5-11 дневные куриные эмбрионы. Яйцо устанавливают в вертикальном положении, тупым концом вверх, скорлупу над воздушной камерой обрабатывают спиртом, йодом, обжигают. После подготовительной работы, скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца на глубину 1-1,5 см материал, объемом 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафином. • Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний. 1. Вирусоскопический - обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптических микроскопов внутриклеточных включений. Классификация ЦПД вирусов в культуре ткани: - равномерная мелкозернистая деструкция клеток (вирусы Коксаки, ECHO, полиовирусы); - очаговая мелкозернистая дегенерация (вирусы гриппа, клещевого энцефалита и др.); - гроздевидная дегенерация (аденовирусы); - крупнозернистая равномерная деструкция (вирус герпеса); - симпластообразование (вирусы кори, осповакцины и др.). Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса. 2. Вирусологические методы - выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов, с последующим их типированием. Методы определения типа вирусов (в вируссодержащем материале) основаны на нейтрализации вирусов типоспецифическими сыворотками. Конечный результат может быть установлен на основании следующих признаков: - нейтрализации ЦПД; - нейтрализации реакции гемадсорбции; - цветной пробе; - задержке (торможении) гемагглютинации; - свечению клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифических флюоресцирующих сывороток; - нейтрализация в опыте на животных. 3. Серологические исследования - обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью РСК, РТГА, ИФА, РПГА, радиоиммунологического метода (РИМ), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс AT + AT в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах), реакции преципитации в агаре и др. Эти реакции, в принципе, могут использоваться и для обнаружения вирусных антигенов. 4. Биологические методы - заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных, с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса. 5. Оценить демонстрационные реакции, сделать вывод. ЗАДАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ УРОВНЯ СФОРМИРОВАННОСТИ КОМПЕТЕНЦИЙ В УЧЕБНОЕ ВРЕМЯ Примеры тестовых заданий 1.ДЛЯ ЗАРАЖЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ЧАЩЕ ВСЕГО ПРИМЕНЯЮТ
2. ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ИСПОЛЬЗУЮТ СРЕДУ
3. К МЕТОДАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ ОТНОСЯТСЯ
4. ОБНАРУЖЕНИЕ В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ВИРИОНОВ ЭТО
5.ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ОТЛИЧАЮТСЯ: 1) большим диапазоном чувствительности ко многим вирусам 2) эмбриональным происхождением 3) ограниченным числом пассажей 4) диплоидностью кариотипа ЛИТЕРАТУРА. Основная:
Дополнительная:
ФГБОУ ВО АМУРСКАЯ ГМА МИНЗДРАВА РОССИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ Методические указания для самостоятельной работы студентов по дисциплине «Микробиология, вирусология» Педиатрический факультет Лабораторное занятие № 11 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Методические указания предназначены для подготовки к практическим занятиям и самостоятельной работы студентов по направлению подготовки... |  | Деловой иностранный язык. Методические указания по выполнению контрольных работ для студентов 2 курса заочной формы обучения, обучающихся... |
| Методические указания предназначены для подготовки к практическим занятиям и самостоятельной работы студентов по направлению подготовки... | | М 545 Методические указания для организации самостоятельной работы студентов по дисциплине «Организация производства и предпринимательство... |
| Методические указания предназначены для студентов II-IV курсов очной формы получения образования спо всех профилей | | Значение языка в жизни общества. Понятие лингвистической экологии. Речевая культура как показатель общей культуры личности. Язык... |
| Методические указания предназначены для студентов I и II курсов экономических специальностей дневного и заочного отделений. Методические... | | Методические указания предназначены в помощь для Вашей самостоятельной внеаудиторной работы с целью самостоятельного изучения и усвоения... |
| Методические указания по выполнению контрольной работы №2 для самостоятельной работы студентов-заочников второго курса, обучающихся... | | Методические указания по выполнению контрольной работы №2 для самостоятельной работы студентов-заочников второго курса, обучающихся... |