Методические указания му 3 1830-04
Скачать 0.71 Mb.
|
2.3.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.1830-04 1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН: А.Л. Гинцбург - руководитель, Н.А. Зигангирова, Б.С. Народицкий, Л.Н. Нестеренко, И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха, Ю.В. Ананьина; Министерством здравоохранения РФ, Департаментом Госсанэпиднадзора МЗ РФ: Г.Г. Онищенко, А.И. Петухов; Институтом питания РАМН: В.А. Тутельян, С.А. Шевелева; Институтом вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН: Б.Ф. Семенов; Московским государственным университетом прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации: И.А. Рогов, А.Ф. Валихов, В.И. Ганина. 2. Утверждены 9 января 2004 г., введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации с 1 февраля 2004 г. 3. Введены впервые. 1. Общие положения и область применения 1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению микробиологической и молекулярно-генетической оценки пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (далее - ГММ). 1.2. Методические указания предназначены для учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также для других учреждений, аккредитованных на проведение работ в этой области в установленном порядке. 1.3. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях в отношении пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, применяются на этапах постановки на производство, санитарно-эпидемиологической экспертизы, выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе, закупки, ввоза в страну и реализации. 1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно обоснованного подхода к оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, на этапах разработки, экспертизы и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения для этой продукции. 1.5. Производитель пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, предназначенной для реализации на территории Российской Федерации, при маркировке должен вносить информацию на этикетку об использовании ГММ в соответствии с установленным порядком. 2. Нормативные ссылки 2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" № 52-ФЗ от 30.03.99. 2.2. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" № 2-ФЗ и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" от 9 января 1996 г. (ред. от 30.12.01). 2.3. Федеральный закон "О качестве и безопасности пищевых продуктов" № 29-ФЗ от 02.01.00. 2.4. Федеральный закон "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" № 86-ФЗ от 05.06.96 (ред. от 12.07.00). 2.5. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Федеральный закон о государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" № 96-ФЗ от 21.06.00. 2.6. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 г. № 5487-1 (ред. от 30.06.03). 2.7. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24.07.00. 2.8. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" № 7 от 06.04.99. 2.9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" № 149 от 16.09.03. 2.10. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01. 2.11. Приказ Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" № 325 от 15.08.01 (ред. от 18.03.02) (зарегистрированный в МЮ РФ 19.10.01, № 2978). 3. Порядок санитарно-эпидемиологической экспертизы и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения пищевой продукции, полученной с использованием ГММ 3.1. Вся пищевая продукция, полученная с использованием жизнеспособных микроорганизмов, проходит санитарно-эпидемиологическую экспертизу в установленном порядке. Заявитель должен декларировать наличие генных модификаций у штаммов, используемых для производства продуктов питания. 3.2. Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы и выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, осуществляется в соответствии с порядком, установленным: - Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" № 7 от 06.04.99; - Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" № 149 от 16.09.03; - Приказом Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" № 325 от 15.08.01 (ред. от 18.03.02) (зарегистрированным в МЮ РФ 19.10.01, № 2978). 3.3. Юридические лица и индивидуальные предприниматели представляют в центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации комплект документов и материалов, включающий: - заявку (письмо) на проведение гигиенической оценки и санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием ГММ; - материалы, отражающие медико-генетическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ; - материалы, отражающие технологические свойства пищевой продукции, полученной с использованием ГММ; - материалы, отражающие медико-биологическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ; - материалы, отражающие молекулярно-биологические и микробиологические характеристики ГММ: 1) документацию, подтверждающую таксономическую принадлежность штамма, установленную по фенотипическим и генотипическим свойствам (паспорт штамма); 2) название штамма, соответствующее кодам Международной номенклатуры; 3) свидетельство о депонировании штамма; 4) документацию, содержащую сведения о фенотипических и генотипических характеристиках штамма, включая информацию о наличии плазмид; 5) документацию, подтверждающую происхождение и подлинность микроорганизма-реципиента, включая документацию о всех известных генетических модификациях его, индуцированных как генно-инженерными, так и традиционными методами; 6) источник и нуклеотидную последовательность целевого гена и его регуляторных элементов; 7) цель генной модификации; 8) происхождение и таксономическое положение штамма-донора, установленные методами молекулярной геносистематики; 9) характеристику средств доставки целевого гена в клетки реципиента (физическую карту вектора, наличие полилинкеров и селективных маркеров); 10) стабильность интеграции чужеродной ДНК в хромосому или плазмиду ГММ; 11) использование транспозонов при конструировании штаммов ГММ; 12) фенотипические, биологические, патогенные свойства ГММ, взаимодействие с резидентной флорой кишечника человека; 13) стабильность генотипических и фенотипических характеристик ГММ; 14) способность к передаче генетического материала от ГММ в резидентную флору кишечника человека и в клетки макроорганизма. Кроме вышеперечисленного, заявитель должен предоставить сведения об официальном разрешении на применение в пищевой промышленности и/или в свободной продаже населению и о разрешении на экспорт из страны продукта с данным ГММ (оригиналы или заверенные копии документов установленного образца). 3.4. Объем и программа проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяются экспертами ГУ НИИ питания РАМН и Центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им. Гамалеи РАМН по результатам экспертизы представленных материалов, а также в зависимости от ее принадлежности к пищевым продуктам на основе: - новых штаммов, не имеющих разрешения на применение в производстве пищевых продуктов; - штаммов, проходивших ранее экспертизу в установленном порядке и допущенных в качестве заквасочных, стартовых, пробиотических, дрожжевых культур и штаммов - продуцентов пищевых веществ и пищевых добавок и используемых в пищевой промышленности. Кроме того, при этом учитывается группа продукции по признаку наличия ГММ в жизнеспособном состоянии на момент потребления: 1) пищевые продукты, содержащие ГММ в живом состоянии, - кисломолочные, пробиотические продукты, напитки брожения и пиво непастеризованные, закваски и стартовые культуры, готовые мясные продукты, изготовленные с использованием стартовых культур; 2) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ и в которых в процессе технологии они были инактивированы (напитки брожения и пиво пастеризованные, термизированные кисломолочные продукты и др.); 3) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ и которые в дальнейшем освобождены от них в процессе производства (ферментные препараты, белки). Для концентрации внимания экспертизы на продукции, представляющей наибольший риск, последняя группа подразделяется на "негативный" и "позитивный" листы, при этом в негативный лист включаются полученные при использовании ГММ продукты, не содержащие белка и ДНК (пищевые кислоты, витамины, жирные кислоты), и ферменты для спиртовой промышленности. Работа по экспертизе продукции, включенной в негативный лист, должна предусматривать первоочередный анализ документальных материалов и в случае необходимости - анализ при помощи лабораторных методов. 3.5. Для проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, фирма-изготовитель поставляет образцы продукции и используемые культуры штаммов ГММ в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований. 3.6. На основании экспертизы представленных документов и материалов и результатов проведенных молекулярно-генетических, микробиологических и технологических исследований продукции центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Минздрава России оформляет бланк санитарно-эпидемиологического заключения (или мотивированное заключение об отказе) и передает его на подпись в Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава России. Санитарно-эпидемиологическое заключение подписывается Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, а в его отсутствие - начальником Департамента Госсанэпиднадзора, заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации. 4. Микробиологическая оценка ГММ, используемых для производства пищевой продукции Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертом центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. 4.1. Сравнительный анализ фенотипических свойств ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма 4.1.1. Сущность метода Сравнительный анализ фенотипических свойств основан на идентификации основных фенотипических свойств исследуемого ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма того же вида для определения стабильности фенотипических признаков. Оптимальными методами исследования фенотипических свойств являются методы идентификации микроорганизмов с помощью диагностических панелей, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенных к использованию в установленном порядке. Данные системы одноразового пользования предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации в течение 18 - 24 часов. Дополнительными методами исследования фенотипических свойств являются чувствительность к антибиотикам, к бактериофагам (для некоторых видов ГММ). 4.1.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды 4.1.2.1. Аппаратура и инструментарий
4.1.2.2. Лабораторная посуда и материалы
4.1.2.3. Реактивы и питательные среды
_________________ * Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке. Питательные среды:
Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя. Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке. 4.1.3. Методика проведения исследования 4.1.3.1. Выделение ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма Чистую культуру ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма выделяют, пользуясь общепринятыми в микробиологии методами на рекомендованной для данного вида ГММ и штамма-реципиента питательной среде. Например, выделение чистой культуры ГММ вида термофильных стрептококков должно осуществляться со среды типа M17 по ГОСТ 51331-99, а лактобактерий - со среды MRS по ГОСТ 51339-99. 4.1.3.2. Постановка реакции биохимической идентификации ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма Из чистой 18 - 24-часовой культуры готовят суспензию в стерильной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от исследуемого вида ГММ и штамма-реципиента. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов. Параллельно суспензию ГММ, штамма-реципиента или контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов. Планшет для идентификации извлекают из полиэтиленовой упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма. Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1 - 0,2 см3) в зависимости от фирмы-изготовителя и вида исследуемого ГММ и штамма-реципиента. После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазелиновое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий. После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5 - 24 часа при оптимальной температуре для исследуемого вида ГММ (например, 25 - 28 °С - дрожжи, 42 °С - лактобациллы). По окончании инкубации проверяют рост и чистоту культуры методом посевов на селективные жидкие или плотные питательные среды. В некоторые лунки (например, ферментация индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3 - 5 часов и через 18 - 24 часа. Результаты учитывают визуально с помощью таблицы "Интерпретация реакций" и заносят в бланки. Идентификацию проводят с помощью таблиц и книг-каталогов кодов соответствующих фирм. Стабильность фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента проверяют методом пассирования ГММ и штамма-реципиента на жидких и плотных питательных средах и дальнейшим через 3 - 5 пассажей трехкратным тестированием биохимических свойств ГММ и штамма-реципиента. Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное при неоднократном пассировании культур (не менее 10 пассажей), будет свидетельствовать о стабильности фенотипических признаков ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по 1 - 2 реакциям будет являться свидетельством необходимости постановки дополнительных тестов на стабильность фено- и генотипических признаков у ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по большему числу реакций будет служить свидетельством нестабильности фенотипических признаков у ГММ. 4.1.3.3. Определение чувствительности к антимикробным препаратам ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма Чувствительность к антимикробным препаратам может быть в ряде случаев хорошим маркером фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента. В определенных случаях, а именно тестирования пробиотиков, определение чувствительности к антимикробным препаратам является обязательным тестом в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ. Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных видов ГММ или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков. Современные стандартизованные методы оценки антибиотикорезистентности подразделяются на методы серийных разведений и диффузионные. В зависимости от вида ГММ и штамма-реципиента, предназначения ГММ тестирование будет выполняться как методом серийных разведений, так и диффузионным методом. 4.1.3.3.1. Подготовка к анализу А. Метод серийных разведений Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы: а) приготовление растворов антибиотиков; б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков; в) приготовление суспензии исследуемого ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция; г) инкубация; д) интерпретация результатов исследования. Общими и очень важными этапами в методе серийных разведений являются: приготовление растворов антибиотиков, питательных сред, смешивание растворов антибиотиков и питательных сред. 4.1.3.3.2. Приготовление растворов антибиотиков Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие, используемые "ex tempore" для приготовления питательных сред. Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле:  Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется стерильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора в случае, если активность антибиотика измеряется в ЕД, производится аналогично. 4.1.3.3.3. Приготовление сред, содержащих антибиотики для серийных разведений Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (в пробирках) и микрометод (в планшетах). Рабочие растворы антибиотиков для обоих методов готовят по одинаковой схеме. Отличием является то, что серийные разведения антибиотика делают не в дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая питательная среда, прошедшая контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя. При постановке методов серийных разведений проводят контроль роста культуры на среде без антибиотика, а качество среды и антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. Контролируется также чистота суспензии ГММ, использованного для инокуляции, путем высева на неселективные среды. 4.1.3.3.4. Учет результатов Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МПК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста. Б. Дискодиффузионный метод Постановка дискодиффузионного метода оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы: - приготовление питательных сред; - приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция; - наложение дисков; - инкубация; - учет результатов. Для получения правильных результатов необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков. 4.1.3.3.5. Приготовление питательных сред Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением чашки Петри расплавленной питательной средой ее устанавливают на строго горизонтальную поверхность, выверенную по уровню. Толщина агарового слоя должна быть 4,0 мм, что достигается при внесении в чашку Петри диаметром 100 мм 25 - 30 мл агаровой среды. Соблюдение указанных требований связано с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя. После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Перед инокуляцией суспензии чашки с плотной питательной средой контролируют на отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек. 4.1.3.3.6. Приготовление суспензии и инокуляция Для приготовления инокулята используют 18 - 20-часовую агаровую или 5 - 6-часовую бульонную культуру исследуемого ГММ. Суспензию доводят до мутности стандарта McFarland 0,5 (конечная концентрация около 1 - 2 х 107 КОЕ/см3). Приготовленный инокулят в количестве 1 - 2 мл вносят на поверхность чашки Петри, равномерно по поверхности агара распределяют покачиванием. Избыток суспензии удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут. 4.1.3.3.7. Наложение дисков Через 15 - 20 минут после инокуляции на поверхность питательной среды вносят диски с антибиотиками. Диски наносят с помощью автоматического распределителя дисков или стерильным пинцетом. На одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с расстоянием между краем чашки и диска, а также между дисками 15 - 20 мм. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом. 4.1.3.3.8. Инкубация и учет результатов Чашки после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют, перевернув их вверх дном, 18 - 20 часов при оптимальной температуре для исследуемого ГММ. После окончания инкубации проводят учет результатов, измеряя диаметр зоны задержки роста с точностью до 1 мм. Для этого пользуются штангенциркулем или кронциркулем, раздвигая их концы до видимой зоны задержки роста и затем измеряя зону задержки в мм с помощью линейки. |
Похожие:
 | Методические указания предназначены для студентов заочной формы обучения по специальности Техническое обслуживание и ремонт автомобильного... |  | Методические рекомендации печатаются по решению Методического Совета гбоу спо со «еэтк» |
| Номинация: «методические рекомендации по освоению учебной дисциплины, междисциплинарного курса, профессионального модуля» | | Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... |
| Выпускная квалификационная работа : Методические указания / М. Р. Ерофеева, И. В. Камышникова. – Братск : гоу впо «БрГУ», 2009. 57... | | Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... |
| Методические указания содержат общие положения, организационные вопросы выполнения и процедуры защиты работ, требования к оформлению... | | Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании пцк по укрупненной группе 140000 Электроснабжение (нпо и спо) |
| Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический... | | Методические указания к выполнению курсовых и дипломных проектов (работ) по специальности «Электромеханика». – Ростов н/Д: Рост гос... |