Учебное пособие к практическим занятиям для обучающихся по основной образовательной программе

III. Приготовление препаратов (объектов) для прижизненного изучения клеток и тканей Объектами прижизненного изучения могут служить тонкие тканевые пленки (брыжейка, плавательная перепонка лягушки), клетки крови, клетки в культуре тканей и др. При суправитальном исследовании клетки помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора или специальной питательной среды, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом. Прижизненные исследования требуют применения специальных методик микроскопирования без использования красителей: фазовоконтрастная, темнопольная, поляризационная, люминесцентная, ультрафиолетовая микроскопия. Примером суправитального окрашивания моежт служить окрашивание бриллианткрезиловым синим ретикулоцитов крови, которое широко используется в клинике в качестве диагностического теста для оценки интенсивности кроветворения. IV. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей. Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3). Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации. Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы. Для приготовления срезов (толщиной 30-50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки. Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов. Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1-2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы. Практическая работа №2 Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования. Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата. Задание: Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности. Таблица 2 Методы и техника микроскопирования Виды микроскопии Разновидности Цели использования Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание. а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь). б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой). Различают: - Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька). - Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами. в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. г) Микроскопия в темном поле. Достигает объектива только свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д. д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов. В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества. Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки. е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом). Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдинга – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм. В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним. Работа с микроскопом. Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа. С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив. Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением. Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость. В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами. Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения. Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение. Чтобы изображение формировалось на фотопленке, окуляр заменяется фотоприставкой. Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований. А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение. Таблица 3 Препараты животной ткани с разным окрашиванием № Препарат Краситель 1. Клетки животной ткани (синее окрашивание) Гематоксилин 2. Клетки животной ткани (розовое окрашивание) Эозин 3. Клетки животной ткани (фиолетовое окрашивание) Гематоксилин - эозин 4. Эпителий канальцев почки (Рис.2.206, стр.368. Атлас)* Гематоксилин - эозин *Гистология, цитология и эмбриология: Атлас: Учеб. Пособие/ О.В. Волкова, Ю.к. Елецкий, Т.К.Дубовая и др.; Под ред. О.В.Волковой, Ю.К. Елецкого.- М.: Медицина, 1996.- 544 с.: ил. – (учеб. Лит. Для студ. Мед. Вузов). – ISBN 5-225-00832-1 Практическая работа №3 Группы гистологических красителей. Цель занятия: Познакомиться с разными типами окрашивания препаратов. Задание: Прочитайте статью. Заполните таблицу 4, перечислив основные группы красителей. Таблица 4 Основные группы красителей Тип красителя Методика окрашивания Окрашиваемые структуры Процесс окраска гистологических срезов. Цель окраски заключается в том, чтобы различные компоненты клеток и тканей выявлялись более отчетливо. Всякая окраска начинается как чисто физический процесс, при котором находящийся в растворе краситель проникает в тканевые поры и накапливается по физическим законам (капиллярность, поверхностное натяжение). За этой фазой следует вторая, представляющая собой химический процесс взаимодействия красителя с химическими компонентами клетки. На третьей стадии во время дифференцировки можно с помощью более сильного растворителя модифицировать получившиеся в начале химические соединения. Процесс гистологической окраски по своей природе настолько сложен, что трудно выявить какую-либо теорию, которая во всей полноте объясняла бы его сущность. Установление того факта, что определенные компоненты клеток и тканей воспринимают и удерживают различные красители с большей или меньшей интенсивностью, позволяет выявлять и отличать друг от друга многочисленные структуры, которые из-за своих показателей преломления были не видны или не ясно видны в неокрашенном состоянии.

Похожие:

	Учебное пособие к практическим занятиям по курсу «Фармацевтическое товароведение» Учебное пособие предназначено для подготовки студентов к лабораторно-практическим занятиям и включает название темы, цель занятия,...		Учебное пособие рекомендуется для самоподготовки студентов к практическим... Учебное пособие разработано кандидатом технических наук, доцентом кафедры общей и неорганической химии И. В. Рыбальченко
	Учебное пособие Учебное пособие предназначено для подготовки студентов экономико-управленческих специальностей по программе группового проектного...		Методическое пособие для обучающихся «оценка функционального состояния пациента» Методическая разработка предназначена для обучающихся специальных дисциплин к практическим занятиям по мдк. 04. 01 «Теория и практика...
	Учебное пособие включает в себя материалы к 9 практическим занятиям... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Учебное пособие «Радиооператор гмссб» ( переработанная и дополненная)... Учебное пособие в первую очередь предназначено для слушателей яхтенных школ вфпс, обучающихся по программе подготовки "Оператор vhf...
	Учебное пособие предназначено для студентов неюридических специальностей... Учебное пособие предназначено для студентов неюридических специальностей для подготовки к семинарским занятиям по дисциплине «Правоведение»....		Методические указания к практическим занятиям по пп. 01 «Учебная... Представлены методические указания к практическим занятиям по учебной практике, образцы документов для выполнения практических заданий,...
	Учебное пособие Рекомендовано Государственным университетом управления... Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по экономическим и другим специальностям, преподавателей, бухгалтеров, руководителей...		Учебное пособие Рекомендовано Государственным университетом управления... Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по экономическим и другим специальностям, преподавателей, бухгалтеров, руководителей...