ПРАВИЛА
ЭТИЧЕСКОГО ОБРАЩЕНИЯ
С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ
ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАБОТ
В НАУЧНОМ ЦЕНТРЕ БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙСОДЕРЖАНИЕ
О правилах GLP 1
Обучение работе с лабораторными животными 6
Категорирование животных 41
Мониторинг здоровья лабораторных животных 45
Технология содержания лабораторных животных 52
Приобретение, транспортировка и карантинирование лабораторных животных 69
Биобезопасность при работе с лабораторными животными 76
Основные принципы проведения экспериментов 81
Стандартные операционные процедуры 92
Доклинические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств и ксенобиотиков 95
Современные тенденции оценки биомедицинской безопасности 111
Совершенствование и развитие биомедицинских технологий, возрастающие требования к контролю качества лекарств, БАДов, нутриентов, ужесточение гигиенических норм для химических, биологических и физических факторов, предъявляют новые требования к качеству и разнообразию лабораторных животных. Потребность в исследованиях на животных растет по мере разработки и внедрения инновационных средств и материалов на основе клеточных технологий, нанобиотехнологий и т.д.
После выхода в свет книги У.Рассела и Р.Берча “The Principles of Humane Experimental Technique” в мир науки вошла концепция гуманного использования животных в экспериментах или более кратко “Концепция 3R”.
Наряду с принципами качественной экспериментальной практики, указанные авторы предложили новую терминологию альтернативного моделирования:
частичное замещение – метод частично исключающий эксперимент на животных;
батарея тестов – серия методов, выполненных в рамках дополнительного многофакторного эксперимента;
стратегия последовательных тестов – выбор каждого теста и их построение осуществляется в виде последовательного процесса, состоящего из серии (батарей) тестов.
Эти и уже многие другие научные подходы, активно разрабатываемые в настоящее время, составляют методологическую и материальную основу как бурно развивающегося альтернативного моделирования, так и биоэтической концепции.
Обучение персонала строится на общепринятых в мировом сообществе принципах категорирования в соответствии с директивами FELASA. Важнейшей проблемой взаимодействия человека с лабораторными животными, является биобезопасность при работе с ними, идентификация опасных факторов и оценка рисков, а также ответственность персонала. С марта 2010 г. в России введены в действие Принципы надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009), предусматривающие приведение всех доклинических, внеклинических и экспертных исследований в соответствие с международными стандартами GLP. Это в свою очередь предполагает унификацию дизайна экспериментов, гармонизацию получаемых результатов и их интерпретацию в рамках требований и стандартов ECVAM, FELASA, OECD, FDA, EPA и др. Это особенно важно в проведении международной кооперации по исследованию генетического полиморфизма человека и животных. В этих случаях, как и во многих других ситуациях, универсальным принципом межлабораторной и международной кооперации является использование стандартных операционных процедур (СОП) – документов, подробно описывающих процедуры манипуляций, которые, как правило, подробно не описываются в протоколах конкретных исследований.
О правилах GLP
Необходимость гармонизации отечественных норм и правил проведения доклинических исследований с международными документами требует стандартизации методических подходов и принципов, включая использование альтернативных моделей. Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP) являются важнейшей интегральной системой для сопоставимости результатов оценки качества получаемых в разных отечественных и зарубежных учреждениях данных.
Современная нормативная база по проведению доклинических исследований на лабораторных животных более или менее полно отражена в документах международных организаций, законах и подзаконных актах отдельных зарубежных стран. В Российской Федерации она находится на начальном этапе. Поэтому необходимо руководствоваться существующими стандартами и требованиями доклинического тестирования как национального, так и международного уровня. В настоящее время в Российской Федерации принят Федеральный закон от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ "Об обращении лекарственных средств", наряду с ним можно руководствоваться существующими отечественными и зарубежными документами:
Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики";
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005 г.;
Документах OECD по гармонизированным принципам Надлежащей лабораторной практики («Principles of Good Laboratory Practice») с внесенными изменениями от 1997 г., инкорпорированные в Директиву ЕС 2004/10/ЕС.
Кодекс федеральных регламентов FDA (Code of Federal Regulations, CFR), 1979 г.
А также разделом 21 в работе «Продукты питания и лекарственные средства» («Food and Drugs») и главой 58 «Надлежащая лабораторная практика для доклинических лабораторных исследований» («Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies»).
Вопросы, касающиеся проведения ветеринарного надзора, регламентируются в ФЗ РФ «О ветеринарии» № 4979-1 от 14.05.1993 г.
Существуют правила безопасности, производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности, утвержденные руководителем департамента ветеринарии Минсельхозпрода России, Главным Государственным ветеринарным инспектором 7 июня 1999 г.
Приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 года «Об утверждении правил лабораторной практики» даны определение и методология применения Стандартных операционных процедур (СОП). В то же время российские GLP не гармонизированы с соответствующими международными принципами, разработанными Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР или OECD), т.е. существующие на данный момент российские СОПы должны быть приведены с международными стандартами. С марта 2010 г. в силу вступил национальный стандарт РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», полностью аутентичный принципам GLP/OECD. Следует отметить, что в результате многолетнего опыта работы НЦБМТ РАМН и ряда учреждений РАН уже наработаны основные пакеты СОПов и существует база для подготовки новых. Тем не менее, СОПы и иные нормативные документы, используемые в Российской Федерации должны соответствовать стандартам, предлагаемым OECD, Международным инженерным консорциумом (IEC), Международной организацией по стандартизации (ISO), Комитетом по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для того, чтобы результаты этих исследований адекватно воспринимались международными организациями.
В 1982 году Генеральной Ассамблеей ООН принята Всемирная хартия природы, а в 2000 году принята Декларация земли – первый международный документ, на основании которых всем формам жизни обеспечивается существование.
В соответствии с вышеизложенными позициями данная работа направлена на обеспечение:
проведения контролируемых исследований на лабораторных животных и альтернативных моделях;
получения достоверных и воспроизводимых экспериментальных данных в опытах с использованием лабораторных животных;
нормального физиологического развития лабораторных животных и состояния их здоровья;
стандартности лабораторных животных по генетическим параметрам и условиям содержания;
стандартных условий содержания лабораторных животных при их воспроизводстве в питомниках и проведении экспериментов в экспериментально-биологических клиниках (вивариях), включая соответствия этих условий требованиям надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice – GLP);
унификации требований к профессиональной подготовке кадров специалистов по работе с лабораторными животными;
унификации требований к ведению необходимой документации по содержанию лабораторных животных при их воспроизводстве и использованию в экспериментальных исследованиях и других видах деятельности;
безопасности работы с лабораторными животными;
уменьшения количества лабораторных животных, используемых в экспериментах;
соблюдения принципа гуманного отношения к лабораторным животным;
охраны окружающей среды;
основы для введения государственного контроля за содержанием лабораторных животных при их воспроизводстве и использовании в экспериментальных исследованиях и других видах деятельности.
Важным элементом создания полноценной базы для проведения доклинических исследований, включая традиционные и наноинженерные вещества и материалы, их токсикологическую экспертизу и оценку безопасности, является международная аккредитация российских учреждений и лабораторий со стороны Ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC).
Биоэтика – это философски-прикладная область знания, охватывающая моральные, юридические и социальные проблемы, такие как отношение человека к диким и домашним животным, а также проблемы, возникшие в связи с бурным развитием биотехнологии и биомедицинских исследований.
Практически единственным методом контроля и экспертизы лекарств, а также изучения биологических реакций на воздействие экстремальных факторов являются экспериментальные исследования только на животных. Наиболее общие принципы, которыми необходимо руководствоваться при проведении контролируемых исследований на живых объектах следующие:
убедительные основания в необходимости планируемых экспериментальных исследований и невозможности замены животного какой-либо моделью или альтернативным объектом исследования;
минимизация количества привлекаемых к исследованию животных за счет стандартизации условий эксперимента, повышения информативности методических приемов, исключения факторов, увеличивающих разброс экспериментальных данных;
принятие необходимых мер, исключающих страдания животных;
обязательное обеспечение надлежащего ухода за животными с учетом особенностей их этологии;
гуманное отношение к животным (студенческая лабораторная работа, учебно-научный эксперимент, тестирование лекарственного препарата и др.).
Право на использование животных в экспериментах имеют высшие учебные, научно-исследовательские и лечебные учреждения, которые имеют специальные лаборатории.
Экспериментальную работу с животными могут проводить только те специалисты, у которых есть разрешение руководства госучреждения, имеющего лицензию на проведение исследовательских работ с использованием животных. Кроме того, эти специалисты несут ответственность за соблюдение правил содержания и использования животных. Исследователи, проводящие эксперименты и вспомогательный персонал должны иметь достаточный опыт. Сотрудники экспериментальной лаборатории, имеющие среднее медицинское, ветеринарное или зоотехническое образование, аспиранты и студенты должны быть ознакомлены с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных за № 755 от 12.08.1977 г.».
При публикации результатов исследований, экспериментатор должен обязательно указать, что проведение данного эксперимента было санкционировано решением Комиссии по биологической этике (КБЭ). Получение разрешения ответственным исполнителем на проведение эксперимента на лабораторных животных, возможно, только после того, когда исполнитель представит в комиссию по биоэтике «Заявку на проведение биоэтической экспертизы», «Программу экспериментального исследования на животных» и «Обоснование необходимости использования животных в данном исследовании» по установленной форме.
Исследователь должен обязательно представить письменное описание эксперимента, в котором должна быть формулировка цели исследования, описание всех экспериментальных процедур и методических приемов, характер и степень дискомфорта и риск возможных осложнений. Описание должно включать физическую активность, диету, прием препаратов, проведение нагрузочных и функциональных проб и др. При планировании эксперимента на животных исследователь должен руководствоваться принципами «трех R» (replacement – замена болезненных для животных экспериментов опытами, не причиняющими страданий; reduction – уменьшение числа опытов с животными; refinement – улучшение методики с целью облегчения страданий подопытных животных). Во всех случаях следует рассмотреть возможность использования альтернативных методов.
Альтернативный метод – это метод, применяемый для уменьшения количества животных, улучшения условий содержания или замены использования экспериментов на животных в биомедицинских исследованиях и проведения тестов с квалификационной или образовательной целью.
Replacement (выбор и замена) – замена в опыте, когда это возможно, высокоорганизованных животных менее развитыми живыми объектами, альтернативными методами: экспериментами на культуре клеток и тканей, изолированными органами, физико-химическими и биохимическими системами, экспериментами на микроорганизмах и растительных объектах, компьютерными и математическими моделями. Возможно использование культур клеток тканей (методы in vitro) при определении общей токсичности химических соединений для человека и животных, оценки иммунотоксичности, нефротоксичности, гепатотоксичности, нейротоксичности, фототоксичности, экотоксичности, канцерогенности. Получены биополимеры эквивалентные человеческой коже.
Для медико-биологических экспериментов, в которых лабораторные животные служат инструментом измерения активности каких-либо веществ, препаратов, например, вакцин, сывороток или гормональных средств, генотип несущественен, вопросы экстраполяции необязательны, поэтому для «биопробы» можно использовать гибриды, как линейных животных, так и аутбредных.
Эксперименты, в которых предполагается моделирование патологических состояний (онкологические исследования, изучение процессов воспаления, иммунитета, мутаций) проводятся только на определенных линия, так как важна роль генетических факторов в развитии изучаемого состояния. Для выполнения исследований влияния различных веществ и факторов внешней среды, можно ограничиться выбором одной линии или гибридной комбинации.
Reduction (адекватность и стандартизация) – это достижение воспроизводимых результатов с использованием минимального количества животных; адекватный выбор лабораторных животных; использование стандартных по микробиологическим, генетическим и экологическим параметрам животных; оптимальное планирование и, что крайне важно, использование статистических методов не только при обработке полученных данных, но и на стадии планирования. Одним из наиболее надежных путей снижения количества животных, используемых в экспериментах, является дальнейшее развитие и осуществление стандартизации лабораторных животных по генотипу, микрофлоре и экологическим параметрам.
Refinement (уменьшение дистресса, боли и страданий) – это улучшение условий содержания лабораторных животных и использования их в экспериментах, уменьшение дистресса животных во время экспериментов и применение обезболивающих средств, но не в ущерб цели эксперимента.
С точки зрения внешних проявлений и физиологии, животные реагируют на непереносимые боль и дискомфорт так же, как и люди. Концепция исследования боли на животных включает в себя представления о том, что животное не должно подвергаться боли в большей степени, чем может выдержать человек.
Валидность моделей
Валидность модели означает, что модель и моделируемый объект подобны или модель правильно отражает действительность. Модель высокой точности отражает существенные моделируемые механизмы, низкой точности – в малой степени соответствует им. Соотношения между валидностью и проблемой оценки животных-моделей можно классифицировать следующим образом.
Животное-модель никогда не является полностью валидированной моделью. В окончательном анализе гипотезы должные быть пересмотрены относительно человека. Потенциальная эффективность модели заключается в ее функционировании, а не в подтверждении или оценке. Нельзя использовать животных для подтверждения гипотезы о недомоганиях у человека. Но можно и нужно изучать на модели гипотезы, касающиеся определенных нарушений здоровья.
Животное-модель, подтвержденные в качестве валидированной модели не всегда эффективны для экспериментальной работы. Валидность в данном случае является лишь отправной точкой для достижения цели. Можно достичь высокой точности модели, которая в результате не даст ничего нового в понимании тех или иных процессов.
Большинство животных-моделей в биомедицинских и психологических исследованиях не являются валидными.
Валидация (validation) – это крупномасштабное внутрилабораторное исследование, подготовленное в условиях независимости и организованное для получения более определенной оценки релевантности и надежности оптимизированного метода для практических целей.
В последние годы под эгидой Европейского Совета в Северной Италии был создан Европейский Центр по утверждению (валидации) альтернативных методов (ECVAM). Центр способствует разработке альтернативных (заменяющих эксперименты на животных) методов, проверяет и утверждает адекватность новых или уже имеющихся методов.
Валидация альтернативного метода – это процесс, при котором уместность применения и его надежность устанавливается для конкретной практической цели.
Новые методы тестирования должны проходить предварительный процесс превалидации, и только после признания того, что этот процесс прошел успешно, они проходят процесс официальной валидации.
Протокол и имитационная модель метода тестирования на первой стадии изменяется в пользу использования альтернативных методов (refine) в обычной лаборатории (с приоритетным экспериментом по использованию теста). Сделанная оценка на второй стадии вносится в протокол, передаваемый в следующую лабораторию с внесением любых необходимых изменений по использованию альтернативных методов в протокол и имитационную модель. В третьей стадии оценивается ревалентность и надежность тестов в условиях независимости в трех или большем количестве лабораторий (две первые также включены в это число).
Превалидация (prevalidation) – внутрилабораторное исследование, имеющее незначительный масштаб, проводимое в три этапа для гарантии того, что протокол и имеющаяся модель метода тестирования достаточно оптимизированы и стандартизированы для включения в официальное изучение валидности.
Результатом превалидационных изучений является то, что в оптимизационный протокол вносится то, что может быть использовано в официальном валидационном исследовании. В превалидации и валидации могут принимать участие на этой стадии исследования различные национальные и международные институты с достаточным количеством знаний и опыта. В стадии превалидированных продуктов (prevalidation) описываются методы, которые следуют за превалидацией и дается представление о критериях для повторимости и прогнозирования результатов. Стадия, предшествующая валидации (undergoing validation), включает статус метода, предшествующего официальной валидации.
Валидность модели означает, что модель и моделируемый объект подобны или модель правильно отражает действительность.
Валидность является следствием надежности: содержание проблемы, повторности и точности измерений, формируют степень того, что измерялось, и что должно было быть измерено. В терминологии моделирования надежность не является следствием подобия или точности соответствия модели объекту, а соответствием измерения соответствующих переменных модели.
|
