Руководство р 2643-10
Скачать 9.37 Mb.
|
Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры 45 - 49 °C, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается. + Ведение культур колифага MS2 и культуры клеток-хозяина E. coli K12 F R + R Str . Процесс ведения культур колифага MS2 и E. coli K12 F Str включает: - восстановление лиофилизированных культур колифага MS2 и E. coli K12 + R F Str ; + R - создание запасов культур колифага MS2 и E. coli K12 F Str для целевого использования. + R Для восстановления лиофилизированной культуры E. coli K12 F Str оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70%-м этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом. После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~ 0,5 мл питательного бульона для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч. После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар по ТУ 42-14-33-75, содержащий стрептомицин. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч. Культуру на скошенном питательном агаре проверяют на способность лизироваться специфическим колифагом MS2, а также на загрязненность фагом. При удовлетворительных результатах указанных проверок культура считается пригодной для проведения исследований с колифагом MS2. + R Для создания запасов рабочей культуры E. coli K12 F Str культуру со скошенного питательного агара со стрептомицином засевают уколом в столбик с полужидким питательным агаром. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение при температуре 4 - 8 °C. Восполнение запасов рабочей культуры проводят через 3 месяца [81]. На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь культуры + R E. coli K12 F Str , приготовленную следующим образом. Культуру, выращенную в пробирке со скошенным питательным агаром со стрептомицином, смывают с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора и по стандарту 9 мутности готовят взвесь в концентрации 10 бактериальных клеток в 1 мл. Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре (37 +/- 1) °C. Концентрация 9 10 бактериальных клеток E. coli содержится в 2 мл. Для восстановления лиофилизированной культуры колифага MS2 оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70%-м этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом. После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~ 0,5 мл питательного бульона для регидратации. Для создания запасов культуры колифага MS2 используют рабочую культуру + R клеток-хозяина E. coli K12 F Str , хранящуюся на полужидком агаре, которую засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч. + После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры E. coli K12 F R Str повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C. Через 2 ч инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS2, инкубацию продолжают до 18 - 24 ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и помещают в холодильник. Титр полученной культуры колифага MS2 определяют следующим образом. Готовят 7 - 8 десятикратных разведений культуры колифага MS2. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного + R агара и взвеси культуры E. coli K12 F Str из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре (4 +/- 2) °C для получения рабочих суспензий фага. Через 18 - 24 ч инкубации подсчитывают число бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний 7 фага. Для использования допускается культура с титром не менее 10 . 7 При получении титра менее 10 фаг можно размножить. Для этого необходимо повторить описанную процедуру. Методика постановки экспериментов. В качестве исходной воды используют водопроводную или природную воду (колодезную, речную), показатели качества которой соответствуют назначению испытываемого дезинфицирующего средства. Водопроводную воду перед использованием дехлорируют нагреванием при температуре 50 - 60 °C с последующим выдерживанием в течение одних суток. В образцах природной воды определяют общее микробное число и общие колиформные бактерии. Исходную воду наливают в емкости с нижним тубусом объемом 5 - 10 л и контаминируют культурами тест-микроорганизмов. После внесения расчетной дозы микроорганизмов воду тщательно перемешивают и отбирают пробы для определения концентрации исходного заражения воды микроорганизмами. Концентрацию исходного заражения воды бактериями определяют следующим образом. Из емкости отбирают 1 - 3 пробы воды (в зависимости от объема емкости) по 3 - 5 мл. Из каждой пробы делают по 3 - 4 последовательных десятикратных разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде, в которых затем определяют число бактерий в 1 мл пробы воды методом мембранной фильтрации. Сущность метода заключается в концентрировании микроорганизмов из определенного объема анализируемой воды путем фильтрования через мембранные фильтры, выращивании посевов при температуре (37 +/- 1) °C на плотной питательной среде и в подсчете количества бактерий в единице объема воды. Используют мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Мембранные фильтры готовят к анализу в соответствии с указаниями производителя. Фильтрование воды проводят с помощью прибора для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм с устройством для создания разрежения 0,5 - 1,0 атм. Воронку и столик прибора перед анализом воды стерилизуют в паровом или воздушном стерилизаторе. На нижнюю часть прибора (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр; прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой); закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора, наливают при соблюдении правил стерильности необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, затем большие объемы воды через один фильтровальный прибор, сменяя каждый раз фильтры. После окончания фильтрования стакан, воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишней влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на плотную питательную среду в чашку Петри так, чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха. При определении числа бактерий E. coli используют питательный агар Эндо, S. aureus, S. typhimurium - казеиновый или мясо-пептонный агар. Под каждым фильтром на обратной стороне дна чашки Петри делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. Посевы с E. coli, S. aureus, S. typhimurium инкубируют при температуре (37 +/- 2) °C в течение 24 - 48 ч. По окончании инкубации учитывают количество выросших на фильтрах колоний и определяют концентрацию тест-микроорганизмов в 1 л воды по формуле: K C = - N x 1000, V где: C - количество тест-микроорганизмов, содержащихся в 1 л воды; K - кратность разведения; V - посеянный объем в мл; N - среднее арифметическое числа колоний, выросших на мембранных фильтрах при высевах одинаковых разведений. Результат анализа при определении числа бактерий выражают числом колониеобразующих единиц КОЕ в 1 л воды. Концентрацию исходного заражения воды колифагом MS2 определяют следующим образом. При исходной концентрации колифага на уровне 5 6 10 - 10 БОЕ/л из емкости отбирают пробу воды объемом 5 - 10 мл. Готовят 3 - 4 последовательных десятикратных разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного + R агара и взвеси культуры E. coli K12 F Str из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C. Через 18 - 24 ч инкубации подсчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага. Подсчитывают число негативных колоний на 2 - 3 чашках с наиболее характерным и четким ростом. По этим данным определяют среднее число колоний, которое умножают на величину наибольшего разведения. 2 3 При исходной концентрации колифага на уровне 10 - 10 БОЕ/л из емкости отбирают пробу воды объемом 150 - 200 мл. Готовят десятикратное разведение в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде. Колифаг определяют в 1 мл из десятикратного разведения, а также в 1, 10 и 100 мл исходной зараженной воды. Посев 1 мл из десятикратного разведения, а также 1 мл исходной воды 5 6 осуществляют как при исходном заражении воды на уровне 10 - 10 БОЕ/л. Посев 10 мл исходной воды осуществляют следующим образом. 10 мл исходной воды вносят в питательный агар двойной концентрации, расплавленный + R и остуженный до 45 - 49 °C, добавляют смыв E. coli K12 F Str из расчета 2 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешивают. Чашки с посевами оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч. Посев 100 мл исходной воды осуществляют следующим образом. В питательный агар двойной концентрации, расплавленный и остуженный до + R 45 - 49 °C, добавляют смыв E. coli K12 F Str из расчета 2 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешивают. Исследуемые 100 мл воды разливают по 20 мл в большие пробирки, нагревают до 35 - 44 °C и немедленно (не более чем через 5 мин. по достижении требуемой температуры) разливают в 5 чашек Петри и сразу же вносят в каждую чашку по + R 20 мл смеси агара с культурой E. coli K12 F Str , осторожно перемешивают. + R Для контроля культуры E. coli K12 F Str в одну чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35 - 44 + R °C, заливают 20 мл приготовленного агара с E. coli K12 F Str и осторожно перемешивают. Чашки с посевами оставляют при комнатной температуре до застывания. Затем чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч. Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах БОЕ на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать. По результатам определения числа частиц колифага в 1, 10 и 100 мл исходной воды рассчитывают исходное заражение воды колифагом и выражают его в БОЕ/л. Для обеззараживания воды ДС вносят в емкость с зараженной водой в необходимых концентрациях и тщательно перемешивают. Через заданные промежутки времени при соблюдении условий стерильности отбирают пробы воды объемом 1 л в стерильные флаконы с внесенным в них нейтрализатором, подобранным в соответствии с рецептурой дезинфицирующего средства, и определяют микробиологические показатели обеззараженной воды. Пробы воды должны быть исследованы не позднее чем через 1 ч после их отбора. При условии хранения проб в холодильнике при температуре 1 - 5 °C допускается проводить анализ не позже чем через 6 ч после отбора проб. Число бактерий культур S. aureus, E. coli, S. typhimurium в обеззараженной воде определяют методом мембранной фильтрации. На начальных этапах обеззараживания воды анализируют не менее двух проб воды, отличающихся по объему в 10 раз и выбранных таким образом, чтобы на одном из фильтров выросло не более 300 колоний. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не касались друг друга. При анализе воды на конечных этапах обеззараживания исследуют объем не менее 1 л, профильтровывая это количество не менее чем через 3 - 4 фильтра. Посевы инкубируют как указано в п. 5.2. Учитывают количество выросших колоний на фильтрах, результат анализа выражают числом бактерий в 1 л воды. Идентификация общих и термотолерантных колиформных бактерий. К общим колиформным бактериям ОКБ относятся грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч. Термотолерантные колиформные бактерии ТКБ входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44,0 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. При отсутствии роста на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, плесневых, прозрачных и расплывчатых колоний через 18 - 24 ч дают отрицательный ответ. При росте на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых слизистых, розовых с темным центром, бесцветных, с отпечатком на обратной стороне фильтра), выполняют оксидазный тест, для чего мембранный фильтр колониями вверх переносят на кружок фильтровальной бумаги, смоченный реактивом для определения оксидазной активности. |
Похожие:
 | «Об утверждении федерального компонента государственных образовательных стандартов начального общего, основного общего и среднего... |  | Федеральным компонентом государственного образовательного стандарта основного общего образования, утверждённого приказом Минобразования... |
| | Настоящее руководство является пользовательским документом для организаций и лиц | |
| | Руководство пользователя «арм грбс» создано для прикладного программного обеспечения (ппо) «асфк (суфд)», обеспечивающего реализацию... | |
| Руководство предназначено для администраторов программного комплекса гнивц курьер «Корпорация» ивключает сведения по | | Руководство пользователя электронного сервиса предоставления информации фссп россии |
| |