2. Колориметрические методы
К группе колориметрических методов определения белка относятся методы Лоури, биуретовый и методы, основанные на связывании белка с органическими красителями.
Методы Лоури и биуретовый метод, ставший уже классическим, обладает высокой чувствительностью: ~ 10 мг/л и широкой линейной областью измерения - до 1 г/л. Но результаты анализа значительно зависят от аминокислотного состава - интенсивность окрашивания различных белков может различаться в 300 и более раз, поэтому метод не нашел широкого применения в практике. Биуретовый метод практически не зависит от аминокислотного состава белков, это реакция на пептидные связи белка: для протекания реакции достаточно наличие дух пептидных связей в молекуле исследуемого вещества, т.е. в реакцию могут вступать низкомолекулярные белки и трипептиды. Метод мало чувствителен к присутствующим в пробе различным соединениям. Линейная зависимость примерно в 10 раз шире, чем у метода Лоури, а чувствительность - в ~ 10 раз ниже. Из-за низкой чувствительности метод не пригоден для определения низких концентраций белка. Чувствительность метода может быть повышена различными модификациями, одна из которых заключается в осаждении белка и его концентрировании. Биуретовый метод с осаждением и концентрированием белка – биурет-ТХУ считается референсным методом для определения белка в моче, но из-за большой трудоемкости анализа для рутинных исследований в клинических лабораториях практически не применяется.
Одними из последних для определения белка в моче являются методы, основанные на связывании белка с органическими красителями. Методы привлекают к себе внимание благодаря простоте и быстроте исполнения, высокой чувствительности. В ряде исследований было замечено, что при связывании белка с красителями спектр поглощения последнего меняется. Эти данные натолкнули на мысль использовать указанные изменения как основу количественного определения белка без его выделения из растворов. Принцип методов основан на взаимодействии белка с органическим красителем, в результате чего образуется окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка в пробе. Методы выгодно отличаются от классических по ряду характеристик и при правильном подборе адекватного белка для калибратора - они весьма перспективны для использования в лабораторной практике. Опыт использования красителей выявил у предложенных методик некоторые недостатки, из которых, прежде всего, следует отметить различия в способности разных белков связывать красители, что, впрочем, характерно и для классических методов. Но, если различия в определениях классическими методами легко объяснить, то механизм реакций, лежащих в основе методов связывания красителей, пока еще недостаточно изучен. Важную роль для этих методов играют pН среды, молярная масса белка и другие факторы, обеспечивающие образование комплекса белок-краситель:- ван-дер-ваальсовые силы, электростатическое взаимодействие с аминогруппами, участие в реакции основных аминокислот и т. д. Изучение механизма реакций, лежащих в основе связывания красителей с белками, поможет более точно понять причины различий в способности разных белков к связыванию и тем самым оценить границы применимости методов. Другим существенным недостатком методов является нарушение пропорциональной зависимости между концентрацией некоторых белков и оптической плотностью комплекса белок-краситель . К таким методам относятся методы основанные на связывании белка с кумасси бриллиантовым голубым, с бромфеноловым синим, с пирогаллоловым красным.
Метод связывания белка с пирогаллоловым красным был предложен в 1983 г Fujita Y. с соавторами .В настоящее время это метод занял одно из первых мест среди методов определения белка в моче, постепенно вытесняя все другие. Коммерческие наборы реагентов с использованием ПГК выпускает множество фирм, среди которых Baуer Diagnostics, Beckman, Biodirect, Biocon Diagnostik, Bio-Rad Laboratories, Eurodiag, Kone, Merck, Randox, Serono, Sentinel CH, Sigma и другие. Оригинальный метод основывается на связывании белка с красителем в кислой среде (рН=2,5). Комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных препаратов, солей, оснований, кислот. Поглощение комплекса глобулин-ПГК-молибдат составляет ~ 70 % от величины поглощения комплекса альбумин-ПГК-молибдат. Для легких цепей иммуноглобулинов эта величина – 52-68 %. Широкое применение в лабораторной практике метод получил после его модификации Watanabe N. с соавторами.. Предложенная модификация позволила расширить линейную область измерения до 2 г/л, которой не обладают методы, использующие другие красители; при этом правильность и воспроизводимость модифицированного метода соответствуют клиническим требованиям. Авторы подобрали состав буферного раствора и оптимизировали концентрации ПГК и молибдата таким образом, что реагент при минимальной абсорбции обеспечивает максимальную чувствительность определения. Влияние оксалатов, присутствующих в моче в концентрации более 3 ммоль/л и понижающих абсорбцию комплекса, устранили введением в реагент соответствующих компонентов. При взаимодействии ПГК с белком пик поглощения красителя сдвигается с 467 нм на 598 нм. Максимальная абсорбция альбуминового комплекса наблюдается при рН 2,5-3,0; глобулинового - при рН 2,25 - 2,50. Оптическая плотность повышается при повышении температуры от 12 до 25°С и остается стабильной при ее изменении от 25 до 37°С. Аналитические характеристики метода: время выхода оптической плотности на постоянные величины для рутинных анализов – 10 мин; воспроизводимость результатов в диапазоне концентраций белка от 0,09 до 4,11 г/л - 1-3 %; правильность определения альбумина - 97-102%, глобулина - 69-72 %; чувствительность метода - 30-40 мг/л; стабильность реагента при хранении в защищенном от света месте - 6 мес. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения менее 2 %. Нормальные величины белка в моче для взрослых – 28-141 мг/сут. Даже с проблемами, создаваемыми различной чувствительностью красителя к различным белкам, данный метод является лучшим среди других методов; прост и удобен для ручного исполнения в клинических лабораториях и для адаптации на автоматических анализаторах. Краситель ПГК не сорбируется на стенках кювет до концентрации белка 5 г/л, поэтому реагент применим и для использования на автоматических анализаторах; метод адаптирован к анализаторам: Hitachi 717; Hitachi 726; Cobas Bio centrifugal и др. При различных заболеваниях белковый состав мочи различен: при нефротическом синдроме в моче содержится в основном альбумин; при миеломе – легкие цепи иммуноглобулинов (белки Bence Jones); тубулярной нефропатии – низкомолекулярные белки. Состав белков при этих заболеваниях отличается различным соотношением альбуминов и глобулинов (А/Г). В этой связи проведено изучение влияния альбуминов и глобулинов в образцах с различным их отношением (А/Г) на результат анализа, а обнаруженные закономерности при этом оценены методами математической логики. Правильные результаты получены лишь в том случае, когда отношение А/Г анализируемого образца соответствовало отношению А/Г калибратора. Влияние белкового спектра на аналитическую погрешность в значительной степени зависит от аминокислотного состава белков: альбумин и глобулины значительно различаются по содержанию некоторых аминокислот - глутамина, серина триптофана, фенилаланина и цистеина. Увеличение доли альбумина при неизменной концентрации общего белка сопровождается возрастанием оптической плотности во всем диапазоне концентраций. Достоверные результаты с реагентом ПГК получаются при условии, что отношение А/Г калибратора и опытных проб > 2; при меньшем отношении ошибка определения резко возрастает. При соблюдении этих условий метод ПГК является лучшим среди методов Лоури, ССК, КБГ. Для устранения различной чувствительности ПГК к альбумину, глобулину и другим белкам и, таким образом, выравнивания результатов при анализе любых белков, не зависимо от их состава, предлагается добавлять к реагенту сульфододецилсульфат (СДС). Взаимодействие ПГК с белками осуществляется через связывание аминогрупп основных аминокислот с сульфогруппами красителя. При добавлении СДС происходит конкуренция между ПГК и СДС за связывание аминокислотных радикалов с сульфогруппами; кроме этого, СДС раскручивает полипептидные цепи и высвобождает дополнительные аминогруппы, которые вступают в реакцию с ПГК. Таким образом, введение в реагент СДС нивелируют чувствительность красителя к различным белкам. Концентрацию СДС подбирали для выравнивания чувствительности ПГК именно к альбумину и глобулину, так как именно они являются основными белками мочи; при этом удовлетворительной оказалась правильность определения и других белков. Изучение влияния состава белка на его определение методами ПГК и ПГК-СДС показало, что в модельных пробах, содержащих альбумин и γ-глобулин с отношением альбумина к глобулину от 0 до 10, открытие белка обоими методами было близким: 79±2,2 и 77±2,1 и практически не зависело от отношения А/Г. В разбавленной миеломной сыворотке крови (А/Г от 0,39 до 2,35), имеющей гетерогенный белковый состав и содержащий альбумин, γ-1, γ-2 глобулины, легкие цепи иммуноглобулинов (моноклональных и /или поликлональных), открытие было различно: для ПГК – 63%; ПГК-СДС – 83%, поэтому авторы рекомендуют именно его для определения белка в моче. Поскольку белковый состав индивидуального образца мочи при рутинных исследованиях установить нереально, чаще всего в качестве белка для калибратора используют альбумин, сознавая при этом, что результаты будут занижены, поскольку глобулины практически всегда присутствуют в моче. Для нивелирования различной чувствительности ПГК к разным типам белков кроме введения в состав реагента СДС, было предложено использовать калибратор, содержащий альбумин и γ -глобулин, в тех же отношениях, которые присутствуют в реальных образцах мочи. Результаты определения белка в моче с использованием различных красителей существенно различаются. Для сближения результатов, полученных с использованием красителей - КБГ и ПГК, была предпринята попытка выбора адекватного и единого калибратора для обоих методов: в качестве калибратора был выбран альбумин; альбумин с глобулином (А/Г) и лиофилизированный мочевой белок (ЛМБ). Эксперименты показали, что отношение средних значений результатов, полученных методами КБГ и ПГК, с использованием в качестве калибратора альбумина и альбумина с глобулином составило 0,69±0,10; правильность полученных результатов была подтверждена анализом контрольного раствора мочи. Использование в качестве калибратора ЛМБ привело к минимальным различиям результатов на контрольном растворе мочи и на реальных образцах мочи, а отношение результатов, полученных данными методами, составило 0,96. Таким образом, проблема рассогласования результатов, полученных различными методами с использованием в качестве калибратора ЛМБ, практически разрешилась; однако это не устранило различную чувствительность красителей к разным белкам. Для практического использования в клинических лабораториях ЛМБ в качестве калибратора он должен быть коммерчески доступен, стабилен и предварительно аттестован референсным методом, таким, как биурет-ТХУ. Но метод биурет-ТХУ не чувствителен, требует значительного расхода белка для точного определения его концентрации. Следовательно, точность оценки концентрации белка референтным методом сомнительна. В дополнение следует отметить, что коммерческий ЛМБ (мочевой калибратор) дорог, имеет небольшую фасовку – 10 мг, поэтому его применение для рутинных анализов не оправдано. Для сравнения результатов, полученных этими методами с использованием для калибратора альбумина или альбумина с глобулином можно применять отношение КБГ/ПГК, равное 0,69±0,10. Различия между методами, определяющими по-разному концентрацию белка, вызваны несколькими факторами: возможностью определять низкомолекулярные белки и пептиды в дополнение к альбуминам и глобулинам; различной чувствительностью реагентов к разным типам белков; различной интерференцией реагентов с пигментами мочи и соединениями, присутствующими в моче. В этой связи каждый метод имеет свой интервал нормальных величин, отличный от других. Метод ПГК по правильности определения белка в моче сравним с методом сухой химии: краситель - пирокатехин фиолетовый-молибдат, анализатор - Cobas Fara. Результаты, полученные этими методами, строго соответствуют друг другу. Различия результатов наблюдались только при концентрации белка в пробе >2,0 г/л, т.е. за линейной областью определения для обоих методов.
|
