3.3.3 Сканирующая электронная микроскопия
Для подготовки клеток к сканирующей электронной микроскопии применяют следующий метод.
1. Клетки, образующие неплотный монослой на покровных стеклах, фиксируют 1-2 ч 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере.
2. Стекла помещают на 1 ч в 1% -ный раствор четырехокиси осмия в фосфатном буфере.
3. Клетки дегидратируют, последовательно помещая стекла в 30, 50, 70, 90 и 100% -ный этанол, а затем на 15 мин в смесь этанола с ацетоном.
4. Стекла дважды обрабатывают 100% -ным ацетоном и сушат С02 в критической точке, используя аппарат для сушки фирмы Polaran Equipment Ltd., Watford, Herts или другой аналогичный прибор.
5. Покровные стекла фиксируют на алюминиевых подложках с помощью клея "Electrocday 915" и покрывают золотом с помощью диодного напылителя Polaron Е5000 или другой аналогичной системы. Подготовленные таким образом препараты можно исследовать методом сканирующей электронной микроскопии.
На рис.5 представлена фотография зараженных пневмо-вирусом клеток, выполненная с помощью сканирующей электронной микроскопии. Обратите внимание на длинные выросты инфицированных клеток.
3.3.4 Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков
Клетки Staphylococcus aureus с помощью поверхностного А-белка связываются с Fc-фрагментами иммуноглобулинов. Этот эффект можно использовать для исследования пространственной локализации вирусного антигена на плазматической мембране зараженных клеток после их обработки противовирусной сывороткой. Стафилококки более удобны, чем покрытые А-белком шарики латекса, полиметил-метакрилата или полистирола, в связи с легкостью получения бактерий и одинаковым диаметром всех бактериальных клеток (около 1 мкм). На поверхности клеток, зараженных многими вирусами, стафилококки распределяются равномерно, но в случае пневмовирусов они специфически связываются с нитевидными выростами, образование которых является уникальной особенностью зараженных этими вирусами клеток. Связывание стафилококков высокоспецифично и подтверждает результаты иммунофлуоресцентного окрашивания, которые свидетельствуют о том, что вирусные антигены на поверхности зараженных клеток локализованы преимущественно в составе нитевидных структур.
Связывание стафилококков с поверхностью зараженных клеток проводят по следующей методике.
1. Клетки выращивают на покровных стеклах до образования монослоя и заражают вирусом. Лучше всего использовать клетки почки кенгуровой крысы, поскольку они высокочувствительны к пневмовирусам и не имеют поверхностных выростов.
2. Зараженные клетки инкубируют в поддерживающей среде, промывают PBS для полного удаления входящей в состав среды сыворотки, затем фиксируют 10-15 мин 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в PBS при комнатной температуре.
3. Клетки обрабатывают противовирусной сывороткой 1 ч при 37 °С.
4. Антисыворотку удаляют, тщательно промывая клетки PBS. К клеткам добавляют суспензию aureus, штамм Cowan, приготовленную по методу Прингла и Парри, или коммерческий препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °С.
5. Несвязавшиеся стафилококки удаляют, быстро промывая стекла PBS, и клетки фиксируют 60 мин при комнатной температуре 2% -ным раствором четырехокиси осмия в PBS. После этого стекла можно подготовить к сканирующей электронной микроскопии и исследовать.
Подсчет числа связавшихся с клетками стафилококков дает возможность количественно исследовать экспрессию вирусных антигенов на клеточной мембране при условии постановки соответствующих контролей.
3.4 Концентрирование вируса
Предложен простой метод концентрирования РСВ преципитацией полиэтиленгликолем.
1. Готовят 36% -ный раствор ПЭГ 6000 в дистиллированной воде.
2. Раствор охлаждают и добавляют к содержащей вирус жидкости до конечной концентрации ПЭГ 6%.
3. Суспензию инкубируют 2 ч при 4°С.
4. Преципитат собирают центрифугированием при 4°С.
5. Супернатант сливают, осадок дважды промывают буферным раствором и ресуспендируют в небольшом объеме.
|
