2.1.2 Цитопатогенное действие
Характерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штаммом вируса, условиями культивирования и типом клеток. Например, при заражении клеток почек африканской зеленой мартышки образуются фокусы агрегированных клеток. Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансформации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуцируемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью (рис.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к формирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало синцитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют способность к делению.
2.1.3 Методы повышения инфекционное ™
Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает выход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зараженных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих условиях в 11 раз. Нисевич и др. сообщили о 100-кратном увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в присутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.
2.1.4 Методы стабилизации инфекционное
Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Добавление MgS04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток.
2.2 Методы определения инфекционности
Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.
1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.
2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.
В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.
3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.
4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 °С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.
5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.
Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.
Обычно для усиления контраста из состава агарового покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет принципиального значения. Окрашивание раствором нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны и подвержены фотохимическому повреждению под действием света.
Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.
|
