Инструкция по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клинико-диагностических лабораториях
Скачать 0.85 Mb.
|
Процедура окраски: - стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга; - мазки заливают раствором 1 на 1 час. Предупреждение: нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной бумаги; - тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой; - обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3 минут; - промывают дистиллированной водой; - гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 1 минуты. Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой; - мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении. 10.4.2. Метод окраски аурамином О Реактивы: - спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77; - кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77; - фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72; - аурамин О-Sigma (2465-27-2); - акридиновый оранжевый, С.I.46005 или перманганат калия, ГОСТ 10163-76; - вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72; - безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66. Приготовление растворов: Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О: Аурамин 0,1 г Этиловый спирт 96° 10 мл. Растворить аурамин в спирте. Раствор 2. Раствор фенола: Фенол кристаллический 3,0 г Дистиллированная вода 87 мл. Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 °C) и растворить его в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл. Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания. Раствор 3. Обесцвечивающий раствор: Концентрированная соляная кислота 0,5 мл Технический 70° этиловый спирт 100 мл. Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к 70° этиловому спирту. Растворы 4. Гасители фона: Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого. а) Раствор перманганата калия: Перманганат калия (KMnO4) 0,5 г Дистиллированная вода 100 мл. Растворить пермганганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев. б) Раствор акридинового оранжевого: Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) 0,01 г Дистиллированная вода 100 мл Акридиновый оранжевый 0,01 г. Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый. Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев. Процедура окраски: - стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга; - мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут; - тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой; - обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут; - промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски; - гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут. При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минут. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться; - мазки промывают дистиллированной водой; - мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении. Нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной бумаги. 10.4.3. Хранение приготовленных мазков Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если больной находится это время в стационаре. Окрашенные флюоресцентными красителями мазки чувствительны к ультрафиолетовому свету, особенно во время процесса бактериоскопии, и способны за несколько секунд обесцветиться. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости сделать паузу перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к полному восстановлению препарата. XI. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТА 11.1. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen Для проведения микроскопического исследования при окраске по методу Ziehl-Neelsen необходимы: - бинокулярный микроскоп; - иммерсионное масло; - капельница для нанесения масла на препарат; - штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны быть расположены в порядке номеров регистрации; - емкость с ксилолом, спирто-эфирной смесью или 70° спиртом, фильтровальная бумага для удаления иммерсионного масла с поверхности просмотренного препарата; - коробки для хранения просмотренных мазков; - мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или марлевые тампоны для протирания линз микроскопа; - бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования; - емкость с дезинфицирующим средством. Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl-Neelsen, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом 90x или 100x и окулярами 7x или 10x. 11.2. Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Ziehl-Neelsen Кислотоустойчивые микобактерий туберкулеза имеют в длину примерно 1 - 10 мкм, в ширину - 0,2 - 0,6 мкм. Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры "V". Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на "бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде "полос". В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования. Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к М.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания. Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora. Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски - при частичной потере кислотоустойчивой окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет. 11.3. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных флюорохромными красителями Для проведения микроскопического исследования при окраске флюорохромами необходимы: - люминесцентный микроскоп; - штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны быть расположены в порядке номеров регистрации; - коробки для хранения просмотренных мазков; - мягкая хлопчатобумажная ткань или марлевые тампоны для протирания линз микроскопа; - бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования; - емкость с дезинфицирующим средством. Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором объективов и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта наблюдения в пределах 250x - 630x. Необходимо использовать объективы, предназначенные для люминесцентной микроскопии. 11.4. Порядок проведения микроскопического исследования Современные микроскопы являются сложными техническими устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации. Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но можно провести самостоятельно, используя рекомендации по настройке и эксплуатации микроскопа (Приложение N 3 настоящей Инструкции). Несоблюдение правил настройки может привести к существенному снижению эффективности микроскопических исследований. Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen, производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа. Исследование рекомендуется производить с помощью бинокулярного микроскопа или монокулярного микроскопа, оснащенного бинокулярной насадкой. При исследовании мазков, окрашенных флюоресцентными красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной из важных особенностей работы с мазками, окрашенными флюорохромами, является то, что они не подлежат длительному наблюдению в выбранном поле зрения, так как интенсивность люминесценции окрашенного объекта быстро снижается. Другой особенностью работы является необходимость строгого соблюдения режима работы люминесцентного микроскопа. Ртутную лампу нельзя выключать ранее чем через 15 минут после ее зажигания. Повторное включение ртутной лампы допускается только через 10 минут после ее выключения (полного ее охлаждения). Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между наблюдениями необходимо закрывать лампу шторкой. Перед началом микроскопического исследования необходимо: - проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для проведения микроскопического исследования оборудования и дополнительных материалов; - снять чехол, которым накрыт микроскоп; - осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой механические части микроскопа; - убедиться в целости оптической системы; - включить осветительную систему и убедиться в достаточности освещения; - с помощью бумажной салфетки или марлевого тампона, смоченного спирто-эфирной смесью, протереть линзы объективов микроскопа; - убедиться в том, что подготовленные для микроскопии окрашенные препараты достаточно хорошо высушены; - с помощью вращения винта грубой фокусировки (макровинта) опустить предметный столик, максимально отдалив его от объектива; - поворотом револьверного устройства установить объектив с малым увеличением (10x) точно над конденсором; - поместить на столик предметное стекло так, чтобы мазок находился прямо под объективом (при этом обязательно убедиться, что мазок находится в верхней плоскости предметного стекла, а не снизу); - закрепить препарат на столике с помощью клемм или препаратоводителя; - с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка для начала просмотра; - раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений, видимых правым и левым глазом исследователя; - глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с препаратом к объективу, но не допускать соприкосновения предметного стекла с линзой объектива; - глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого используют регулятор накала лампы, темные или матовые фильтры и лишь в крайнем случае изменяют степень открытия диафрагмы. Положение конденсора не изменяют; - продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы объектива. Обычно для получения изображения достаточно несколько поворотов винта; - затем, глядя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими поворотами микровинта настроить изображение до получения достаточной резкости. Никогда не поднимайте столик микроскопа, глядя в окуляр. Это может привести к соприкосновению фронтальной линзы объектива с предметным стеклом, повреждению линзы или порче препарата; - глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать изображение; - глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать изображение путем поворота дополнительного фокусировочного кольца, расположенного на левом окуляре. Для исследования объекта с большим увеличением с помощью "сухой" оптической системы, глядя на препарат сбоку, выбрать объектив с более сильным увеличением. Убедиться, что этот объектив не касается предметного стекла, и поворотом револьверного устройства переместить выбранный объектив, установив его непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться почти в фокусе объектива. С помощью микровинта сфокусировать резкость изображения. Правильная настройка света также может улучшить качество изображения. Все манипуляции по настройке проводятся при сфокусированном на объект микроскопе. При настройке объект должен быть выведен из поля зрения, иными словами, после получения резкого изображения объекта предметное стекло смещается таким образом, чтобы поле зрения под объективом было прозрачным. Работа с объективом масляной иммерсии. Порядок работы: - добиться четкого изображения объекта в поле зрения с помощью сухого объектива малого увеличения и определить наиболее подходящий для исследования участок препарата; - поворотом револьверного устройства сместить сухой объектив так, чтобы стал свободным доступ к препарату; - нанести на выбранный участок препарата одну каплю иммерсионного масла. Капля должна свободно упасть на стекло (при этом желательно немного смазать иммерсионным маслом фронтальную линзу объектива). Пипетка капельницы масла ни в коем случае не должна соприкоснуться с мазком. Это может привести к переносу микобактерий с одного мазка на другой, к загрязнению иммерсионного масла и получению ложноположительного результата микроскопического исследования; - поворотом головки револьверного устройства установить объектив с сильным увеличением (90x - 100x) непосредственно над препаратом; - глядя сбоку, под контролем глаза медленно вращать макровинт грубой фокусировки и поднимать столик микроскопа до появления мениска в момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с поверхностью капли масла; - глядя в окуляр, с помощью винтов грубой и топкой регулировки произвести настройку на резкость. Во время выполнения этой манипуляции будьте особенно внимательны и смещайте винты на небольшой ход, не допуская бесконтрольно полного оборота винтов. В случае появления и поле зрения пузырьков воздуха операцию настройки (момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с иммерсией) необходимо повторить, предварительно удалив масло с объектива. При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Ziehl-Neelsen, следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения. |
Похожие:
 | ... |  | Мкб-10 и наименования вида высокотехнологичной медицинской помощи в соответствии с перечнем видов высокотехнологичной медицинской... |
| В данном материале приведены исследования, проводимые медицинским персоналом диагностических служб по определенным специальностям... | | ТБ/у "Направление на проведение микроскопических исследований на туберкулез" (далее Направление) выдается больному с подозрением... |
| Цель практики дать студентам теоретические знания и выработать практические умения, необходимые для выполнения клинических лабораторных... | | Применение стандартизованной технологии должно обеспечить сравнимые результаты исследований, полученные в разных лабораториях |
| Клинико-статистическая группа заболеваний – группа заболеваний, относящихся к одному профилю стационарной/стационарозамещающей медицинской... | | Методические рекомендации предназначены для врачебного и среднего медицинского персонала клинико-диагностических отделений лечебно-профилактических... |
| Инструкция по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики спид. Утверждена 05. 07. 1990 г | | Клинико-экспертная работа (кэр) в лечебно-профилактических учреждениях осуществляется с целью |