Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Кафедра эпидемиологии,
паразитологии и дезинфектологии
Направление подготовки 32.04.01
Общественное здравоохранение
Факторы риска заражения Blastocystis spp.
Выполнила Домбровская Диана Анатольевна
Научный руководитель
канд. мед. наук, доцент
Гончаров А.Е.
«Допустить к защите
Зав. кафедрой
З.д.н., д.м.н.,
профессор Зуева Л.П.
__________________________
(подпись)
«______»_____________2016 г.
Санкт-Петербург
2016
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1 БЛАСТОЦИСТНАЯ ИНВАЗИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 10
1.1 Современное представление о бластоцистной инвазии. 10
1.2. Клиническое значение. 12
1.3. Эпидемиологическое значение бластоцистной инвазии 13
1.4. Факторы риска заражения Blastocystis spp. 15
1.5. Лабораторная диагностика 16
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 19
2.1. Общая характеристика исследования 19
2.2. Характеристика обследованных лиц 19
2.3. Сбор, транспортировка и хранение материала 20
2.4. Идентификация Blastocystis spp. 22
2.5. Внутривидовое генетическое типирование Blastocistys .sp. 22
2.6. Анкетирование исследуемой группы 24
2.7. Определение основных компонентов кишечной микробиоты с использованием тест-систем «Колонофлор-16» и «Прото-скрин» 24
2.9. Статистическая обработка результатов 25
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 25
3.1. Сравнительная оценка санитарно-эпидемиологического благополучия в Чукотском автономном округе и Санкт-Петербурге 25
3.2. Характеристика обследованных больных 31
3.3. Результаты обследования популяции ЧАО и СПб на бластоцистную инвазию. 33
3.4. Результаты генетического типирования. 38
3.5. Результаты исследования факторов риска. 40
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 44
ВЫВОДЫ: 49
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 51
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования.
Из года в год на территории Российской Федерации сохраняется напряженная ситуация по инфекционным кишечным заболеваниям. За последние десять лет отмечается тенденция к увеличению заболеваемости инфекциями этой группы. Среди острых кишечных инфекций (ОКИ) значительным остается процент острых кишечных инфекций с неустановленной этиологией (ОКИНЭ). На долю ОКИНЭ приходится порядка 63-65% от всех ОКИ. По данным государственного доклада Роспотребнадзора «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2014 году» острые кишечные инфекции неустановленной этиологии занимают третье место по экономической значимости, уступая лишь туберкулезу и острым респираторным инфекциям. Ущерб, нанесенный ОКИ неустановленной этиологии в 2014 году, оценивается в 12,8 миллиардов рублей. Сложившаяся ситуация указывает на сохраняющуюся высокую активность путей передачи - водного, пищевого и контактно-бытового. Эти пути передачи являются общими для возбудителей вирусной, бактериальной и паразитарной природы. Таким образом, помимо классических патогенов, хорошо известных и эффективно выявляемых, свой потенциал к эпидемическому распространению получают новые или малоизвестные агенты. Одним из таких малоизученных патогенов является Blastocystis spp. - возбудитель бластоцистоза.
Бластоцистоз – паразитарное заболевание, вызываемое простейшими Blastocystis spp. (бластоцисты). Бластоцисты – род одноклеточных, эукариотических микроорганизмов, паразитирующих в толстом кишечнике человека и животных.
Микроорганизм известен с начала ХХ века, когда впервые в 1911 году был описан Alexieff. В 1912 год Brumpt выделил и идентифицировал бластоцисты в материале от человека. На протяжении длительного периода времени микроорганизм расценивался как комменсал, не имеющий значительного медицинского значения. В последние годы ситуация изменилась, так как стало появляться все больше данных о связи Blastocystis spp. с заболеваниями желудочно-кишечного тракта [64]. В настоящее время активно дискутируется вопрос об этиологической роли бластоцистной инвазии в развитии острых и хронических кишечных расстройств, синдрома раздраженного кишечника, а так же внекишечных заболеваний (дерматозы) [10,46].
По некоторым оценкам порядка одного миллиарда человек на Земле инфицированы Blastocystis spp. [57]. Инвазия имеет убиквитарных характер, то есть встречается повсеместно, однако превалентность распределена не равномерно и может быть низкой в таких странах как Япония (0,5 до 1%) и Сингапур (3,3%) и высокой в развивающихся странах: Аргентина (27,2%), Бразилия (40,9%), Куба (38,5%), Египет (33,3%), Индонезия (60%) [64].
О проявлениях эпидемического процесса бластоцистоза на территории России можно судить, опираясь лишь на небольшое количество исследований. В исследовании, проведенных Н.М. Коза и соавторами в 1997–2001 гг. в Перми, бластоцистная инвазия выявлена в 13,1% случаев [7]. В Омске по результатам однократных обследований населения в 1999–2001 гг. частота обнаружения Blastocystis spp. у здоровых составляла от 0,9 до 2,3% [15]. В Санкт-Петербурге, в исследовании А.С. Сигидаева и соавторов, было проведено обследование лиц с хроническим вирусным гепатитом, показатель превалентности составил 28,8%, у лиц с другими заболеваниями желудочно-кишечного тракта – 5,5% [13].
Данные различных работ указывают на ряд потенциальных факторов риска: социально-экономическое неблагополучие, контакт с зараженными животными, употребление контаминированной воды и пищи, иммиграция и путешествия в тропические страны [64]. Так же предполагается, что к группам риска относятся лица страдающие от хронического вирусного гепатита В, ВИЧ-инфицированные и лица с иммунодефицитом.
Оценки эпидемиологической обстановки по бластоцистозу на территории России препятствует отсутствие достаточного количества эпидемиологических исследований. Диагностика, группы риска, пути передачи, профилактические мероприятия – актуальные вопросы, которые на сегодняшний день остаются открытыми. Исследование различных популяций, проживающих на территориях с выраженными климатическими, социальными, экономическими и санитарно-гигиеническими особенностями может помочь в выявлении некоторых закономерностей в эпидемиологии возбудителей инфекционных заболеваний.
Степень разработанности темы.
За последние десять лет проблема бластоцистной инвазии приобрела широкий интерес среди множества исследователей различных стран мира. На сегодняшний день база данных научных публикаций PubMed насчитывает более 1200 наименований работ посвященных проблеме. В научной литературе достаточно полно проработаны вопросы, касающиеся биологических свойств Blastocystis, но в тоже время открытыми остаются важные медицинские вопросы. В частности не решенными остаются вопросы клинической значимости микроорганизма и его эпидемиологии. Если в дискуссии об этиологической роли микроорганизма в развитии острой кишечной инфекции достигнут консенсус, то влияние хронической инвазии активно обсуждается. Оценку клинического значения хронической инвазии в значительной степени затрудняют противоречивые результаты исследований. Так ряд авторов указывают на связь бластоцистной инвазии с синдромом раздраженного кишечника (СРК) и кожными заболеваниями, такими как атопический дерматит и крапивница и настаивают на патогенности микроорганизма [10,22,46]. С другой стороны существуют данные, демонстрирующие возможную профилактическую роль Blastocystis в отношении воспалительных заболеваний кишечника – болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (НЯК). Авторы этой работы рассматривают возможность применения культур Blastocystis в качестве пробиотического препарата [41]. Помимо этого, до сих пор остается значительный пробел в понимании эпидемиологических особенностей бластоцистной инвазии. Основываясь на имеющихся на сегодняшний день результатах эпидемиологических исследований, можно предполагать, что эпидемиологические особенности бластоцистной инвазии не имеют универсального характера и варьируют от региона к региону. Данные по эпидемиологии бластоцисной инвазии в Российской Федерации немногочисленны и имеют отрывочный характер, что препятствует адекватной оценке ситуации сложившийся на территории страны.
Цель исследования - провести эпидемиологическую оценку широкого спектра социальных, поведенческих и биологических факторов риска инфицирования Blastocystis spp. в географически дистантных популяциях (Чукотский полуостров, Санкт-Петербург).
Задачи исследования:
провести сравнительную оценку санитарно-эпидемиологического благополучия в Чукотском автономном округе и Санкт-Петербурге по данным отчетной документации управлений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека;
определить превалентность бластоцистной инвазии в различных группах населения с использованием метода полимеразной цепной реакции;
установить распространенность отдельных субтипов, провести внутривидовое генетическое типирование выявленных штаммов;
провести анкетирование исследуемой популяции для сбора информации о потенциальных факторах риска заражения бластоцистной инвазией;
установить потенциальные факторы риска инфицирования Blastocistis spp. в исследовании случай-контроль;
оценить возможную взаимосвязь между наличием бластоцистной инвазии и дисбиозом кишечника.
Положения, выносимые на защиту.
1. Бластоцистная инвазия представляет собой протозойную инвазию широко распространенную в различных по географическому, социально-экономическому, и демографическому положению регионов.
2. Субтипы бластоцист ST1, ST2, ST3 являются глобально распространенными.
3. Наличие дерматологических заболеваний в анамнезе статистически значимо связано с бластоцистной инвазией.
Научная новизна исследования.
В настоящей работе впервые было проведено исследование эпидемиологических особенностей бластоцистной инвазии на территории Чукотского Автономного Округа - территории специфической с социальной, экономической и санитарно-гигиенической точек зрения. Определена превалентность бластоцистной инвазии, а так же установлена распространенность отдельных субтипов бластоцист в изучаемых группах населения. Получены данные указывающие на возможную связь бластоцистной инвазии и кожных заболеваний.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Теоретическая значимость результатов работы заключатся в дополнении знаний о распространенности различных генетических субтипов Blastocystis spp., циркулирующих на территории Российской Федерации. Данные, полученные в исследовании, указывающие на связь инвазии с кожными заболеваниями, возможной связью с вирусными гепатитами и дисбиозом кишечника, в очередной раз подчеркивают клиническую значимость микроорганизма, а так же указывают на целесообразность дальнейших исследований патогенеза бластоцистной инвазии.
С практической точки зрения выводы, полученные в результате работы могут быть учтены при разработке профилактических мероприятий и организации эпидемиологического надзора за бластоцистной инвазией.
Дизайн и методы исследования.
В качестве дизайна исследования для выявления потенциальных факторов риска был выбран дизайн – «случай-контроль». Выбор дизайна исследования обоснован тем, что в качестве вероятных факторов риска рассматривалось одновременно множество факторов, таких как социальный и экономический статус, туризм, наличие различных хронических заболеваний, контакт с животными, употребление недоброкачественной воды и пищи. Сбор информации осуществлялся наиболее доступным способом – посредствам анкет-опросников, заполняемыми участниками исследования.
Идентификация Blastocystis spp. в клиническом материале производилась методом полимеразной цепной реакции с родоспецифическими праймерами. Выбор ПЦР в качестве основного метода идентификации обусловлен в первую очередь более высокой по сравнению с микроскопией чувствительностью, а так же тем фактом что, при транспортировке образцов из Чукотского АО и последующем хранении образцы могли быть многократно подвержены воздействию резких перепадов температур, оказывающих разрушительное воздействие на структуры микроорганизма. При таких условиях микроскопический метод в большей степени подвержен снижению чувствительности, чем ПЦР идентификация. Определение принадлежности выявленных штаммов Blastocystis так же проводилось с помощью полимеразной цепной реакции со субтипспецифическими праймерами. Для части штаммов было проведено секвенирование фрагмента ДНК малой рибосомальной субъединицы SSUrDNA, так называемого Barcode-участка, имеющего филогенетическое значение.
Внедрение результатов исследования.
Результаты работы могут быть использованы при разработке методических рекомендаций для врачей-эпидемиологов, паразитологов, инфекционистов, врачей клинической лабораторной диагностики по профилактике кишечных протозойных инвазий, разрабатываемых кафедрой эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Материалы работы будут использованы в учебном процессе.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 55 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 9 рисунков. В работе использованы 15 отечественных и 60 иностранных источников литературы.
ГЛАВА 1 БЛАСТОЦИСТНАЯ ИНВАЗИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 Современное представление о бластоцистной инвазии.
Бластоцистоз – паразитарное заболевание, вызываемое простейшими Blastocystis spp. (бластоцисты). Бластоцисты – род одноклеточных, эукариотических микроорганизмов, паразитирующих в толстом кишечнике человека и животных. Бластоцисты распространены повсеместно и являются одним из наиболее часто выявляемых организмов при паразитологических исследованиях [64]. Предположительно порядка одного миллиарда человек в мире инвазировано бластоцистами [54].
Первые описания бластоцист появились в начале ХХ века. Впервые микроорганизм был описан Alexieff в 1911 году. В 1912 году Brumpt выделил и идентифицировал бластоцисты в материале от человека [24].
Известны четыре морфологические формы бластоцист: вакуолярная, гранулярная, цистная и амебоидная. Вакуолярные формы наиболее часто встречаются при паразитологических исследованиях в лабораторных культурах. Они имеют сферическую форму, размеры варьируют от 2 до 200 мкм [59]. Цитоплазма содержит органеллы, характерные для эукариотических клеток, несколько ядер, оттесненных центральной вакуолью к периферии. Центральная вакуоль обычно содержит различный материал – гранулы или хлопьевидный материал различной степени плотности. Цистная форма характеризуется многослойной клеточной стенкой и малым размером центральной вакуоли с 1-4 ядрами [44]. Гранулярная (зернистая) форма характеризуется наличием внутриклеточных гранул, является регулярно наблюдаемой формой, преимущественно в лабораторных культурах. Амебоидная форма – амебоподобные клетки меняющейся формы с псевдоподиальным выпячиванием цитоплазмы встречается редко и только в образцах от больных с диарей. Обнаружение амебоидной форма паразита в клиническом материале может рассматриваться в качестве индикатора патогенности [12]. Содержит различные вакуоли с бактериями и без них, а также трудно дифференцируемые ядра [9].
Заражение человека и животных осуществляется цистами, которые развиваются в вакуолярную форму в толстом кишечнике. Вакуолярная форма делится митозом и может развиться в амебиоидную либо в гранулярную форму. Из вакуолярных форм так же формируются цисты, которые могут попадать в окружающую среду и инфицировать нового хозяина.
Первоначально бластоцисты ошибочно классифицировались как грибки, дрожжи и даже цисты Trichomonas spp., их относили к различным классам простейших [73]. В 1996 году, на основании анализа полной последовательности гена кодирующего малую субединицу рибосомальной РНК (SSU-rDNA), была установлена принадлежность микроорганизма к царству Stramenopiles, включающего одноклеточные и многоклеточные водоросли [52]. Современное систематическое положение бластоцист - царство Stramenopiles, подцарство Chromobiota, подтип Opalinata, класс Blastocystea, отряд Blastocystida, семейство Blastocystidae, род Blastocystis [16]. Род Blastocystis – единственный известный на сегодняшний день представитель царства Stramenopiles, паразитирующий в организме человека и других млекопитающих.
Представители Blastocystis spp., выделяемые от человека и животных, не имеют значительных морфологических различий [53,60,61,71]. Однако молекулярно-биологические исследования показали чрезвычайно широкое генетическое разнообразие представителей рода. На сегодняшний день известно 17 генетических субтипов бластоцист [70]. Установлено, что в организме людей встречаются субтипы с первого по девятый (ST1-ST9), при этом третий субтип считается преимущественно антропонозным, а остальные зоонозными. Ранее существовавшее мнение о видоспецифическом паразитизме бластоцист оказалось не верным. В связи с этим были предложены изменения в номенклатуре, было решено отказаться от видовых названий в пользу обозначения генетического субтипа, штамма. Согласно современной классификации используется название Blastocystis species subtype n., где n – число, указывающее субтип микроорганизма. Ранее употребляемый термин – «Blastocystis hominis» в настоящее время считается устаревшим [57].
1.2. Клиническое значение.
Вопрос о клиническом значении бластоцистной инвазии на сегодняшний день остается открытым. Течение инвазии может значительно варьировать по степени клинической выраженности от бессимптомного носительства до острых профузных диарей.
Как правило бластоцистоз проявляется такими неспецифическими симптомами как тошнота, рвота, потеря веса, боли в животе, вздутие, метеоризмы, может протекать как острая или хроническую диарея. Самыми распространнеными симптомами у больных являются боли в животе и понос [28,37]. Вероятно, что у пациентов с бластоцистная инвазия могут быть следующие симптомы: зуд [32], прямокишечное кровотечение [30], эозинофилия [33], спленомегалия и гепатомегалия [29].
Часто бластоцисты определяются у лиц, не имеющих каких-либо жалоб со стороны желудочно-кишечного тракта. С другой стороны, в исследованиях показана связь бластоцистной инвазии с острыми и хроническими кишечными расстройствами, с синдромом раздраженного кишечника (СРК) [22,31,69], внекишечными заболеваниями, в частности дерматозами и аллергические заболеваниями [19,34,75]. Так в результате проведения систематического обзора и мета-анализа 11 опубликованных исследований связи бластоцистной инвазии и синдрома раздраженного кишечника, включающего в общей сложности 1728 пациентов с СРК и 1292 пациента контрольной группы, было показано, что относительный риск развития СРК у инвазированых составляет 2.34 (ДИ 95% 1,82 – 3,00, p = 0,001) [46].
Интересно, что множество исследований также свидетельствуют о причинно-следственной связи между Blastocystis и кожными поражениями [17, 36, 43, 66]. В этих исследованиях, присутствие паразита было зафиксировано у пациентов с острой или хронической крапивницей [17, 36, 66], отеком Квинке [43]. Лечение паразита приводит к исчезновению и инфекции, и кожных повреждений.
У больных хроническими дерматозами выявлена высокая частота встречаемости паразитозов, среди которых доминирующее положение занимают простейшие Blastocystis spp. Инвазированность бластоцистами пациентов с атопическим дерматитом составляет 89,5%, артропатическим псориазом – 81,5%, вульгарным псориазом – 79,8%, экземой – 71,7%, красным плоским лишаем – 67,7% и микробной экземой – 62,3% и нарастает с увеличением возраста больных и продолжительности заболевания. В период обострения заболевания, по сравнению с ремиссией, повышается не только частота встречаемости Blastocystis spp., но и их вирулентность, а также резистентность к антипротозойным препаратам [10].
Необходимость лечения лиц, не имеющим клинических проявлений и с небольшим количеством цист, является спорной [18, 27]. В случаях, когда лечение является оправданным, то обычно используется метронидазол в качестве терапии первой линии. Если метронидазол не является эффективным, обычно используется либо Ко-тримоксазол или нитазоксанид в качестве терапии второй линии [25].
В настоящее время есть ряд исследований, указывающих на связь бластоцистной инвазии с дисбиотическими изменениями кишечника [2, 4].
1.3. Эпидемиологическое значение бластоцистной инвазии
Заболеваемость бластоцистозом значительно варьирует в разных странах и популяциях.
Отмечено, что в развивающихся странах превалентность выше, чем в развитых, что связывают с более низким санитарно-гигиеническим уровнем, контактом с зараженными животными, употреблением контаминированной воды и пищи. Показана относительно низкая пораженность бластоцистозом в таких странах как Сингапур (3,3%) и Япония (0,5 до 1%) и высокая в таких развивающихся странах как Индонезия (60%), Бразилия (40,9%), Куба (38,5%),Египет (33,3%), Аргентина (27,2%) [64].
На сегодняшний день бластоцистная инвазия на территории России не подлежит регистрации, не входит в формы государственной статистической отчетности. О проявлениях эпидемического процесса бластоцистоза можно судить, опираясь лишь на небольшое количество превалентных исследований.
В исследованиях, проведенных Н.М. Коза и соавторами в 1997–2001 гг. в Перми, бластоцистная инвазия выявлена в 13,1% случаев [7]. В Омске по результатам однократных обследований населения в 1999–2001 гг. частота обнаружения Blastocystis у здоровых составляла от 0,9 до 2,3% [15].
В исследовании А.С. Сигидаева и соавторов показано, что годовая динамика выявления бластоцист в испражнениях людей имела подъем в летний период с пиками в июле и августе. По мнению авторов это связано с тем, что на летний период приходится основная пора отпусков, усиливаются миграционные процессы, увеличивается употребление фруктов и овощей, а также контакт с почвой (работы на садовых участках и огородах). Данных о возрастной структуре заболеваемости на сегодняшний день нет [13].
В ряде исследований освещаются вопросы географического распространения заболеваемости бластоцистозом, определяемом различными субтипами. В частности, в исследовании Yoshikawa et al., включающем генетическое типирование штаммов из Бангладеша, Германии, Японии, Пакистана и Таиланда, было показано, что для четырех географически удаленных популяций, исключая Тайланд, субтип 3 является преобладающим (92,3%), за ним следуют субтип 1 (от 7,7 до 25%) и 6 (от 10 до 22,9%) [70].
Похожая внутривидовая структура описана в Сингапуре (78% субтип 3 и 22% субтип 1) [68], в Китaе (60.4% субтип 3 и 24.5% субтип 1) [40], Греции (60% субтип 3 и 20% субтип 1) [42], Германии (54% субтип 3 и 21% субтип 1) [21] и Турции (75.9% субтип 3) [48]. Таким образом, субтипы Blastocystis sp. 1-3 являются преобладающими в глобальной структуре данного возбудителя.
1.4. Факторы риска заражения Blastocystis spp.
В качестве факторов риска бластоцистной инвазии в литературе рассматриваются иммунодефицитные состояния, контакт с животными, низкий санитарный и гигиенический уровень, употребление недоброкачественной воды, иммиграция и путешествия в тропические страны, контакт с почвой. Большое число превалентных исследований рассматривает водный путь распространения бластоцистной инвазии как ведущий, обусловленный контаминацией воды устойчивыми к неблагоприятным воздействиям цистами.
При паразитологическом обследовании коллективов тайской армии наибольшее число находок пришлось на бластоцисты, превалентность составила 21,9% [62].Такой высокий процент пораженности был достоверно связан с употреблением нефильтрованной, некипяченой воды.
В исследовании внутривидовой структуры бластоцист с применением ПЦР генотипирования с STS праймерами среди 238 случайно выбранных жителей сельской местности Китая параженность составила 32,6%. При этом инфицирование субтипом 1 было ассоциировано с употреблением сырой родниковой воды, в то время как инфицирование субтипом 3 было ассоциировано с употреблением некипяченой воды централизованного водоснабжения [40].
Возможность водного пути распространения возбудителя обусловлена устойчивостью цист к неблагоприятным факторам внешней среды. В воде цисты могут оставаться жизнеспособными до 19 дней, однако чувствительны к замораживанию, нагреванию и дезинфектантам [72]. Yoshikawa показано, что цисты могут выживать до одного месяца при температуре 25°C и до двух месяцев при 4°C [45].
Blastocystis инфекции широко распространены среди представителей определенных профессий, в том числе, предполагающих контакт с животными, что в ряде случаев доказывает зоонозную природу организма. Отмечена высокая заболеваемость бластоцистозом рабочих, ухаживающих за животными в зоопарках и работников скотобоен [49, 50]. В исследованиях [26, 38] указывается, что работники общепита также являются группой риска.
Также известно, что высокая пораженность Blastocystis ассоциирована с различными хроническими заболеваниями, в том числе с аллергическими заболеваниями кожи [10, 47] ВИЧ-инфекцией [39, 23], хроническими вирусными гепатитами [13].
Дети также могут представлять собой группу риска [63].
1.5. Лабораторная диагностика
Микроскопия. Для диагностики бластоцистной инвазии применяют ряд диагностических методов, на первом месте из которых стоит микроскопия нативного мазка. В настоящее время существуют методы окрашивания мазка раствором Люголя, трихромом, по Романовскому – Гимзе. Метод является наиболее доступным, простым и в тоже время достоверным. Однако классическая вакуолярная форма зачастую не является преобладающей в каловых массах, в тоже время мелкие цисты тяжело идентифицировать (имеют сходство с каплями жира и Cyclospora sp., дрожжами). Клинические проявления инвазии отмечается при обнаружении более пяти паразитов в поля зрения при Х400 увеличении в мазке фекалий [56].
Метод обогащения. Также в литературе описан метод обогащения, направленный на концентрацию цист бластоцист в осадке. В основе метода формалин-эфирной обогащения лежит разность удельного веса используемых химических реактивов и цист Blastocystis spp., в результате чего они скапливаются в осадке. Данный метод не увеличивает чувствительность прямой микроскопии, обладает низкой чувствительностью по сравнению с ПЦР, методом трихромного окрашивания мазков и культуральным методом [55, 58]. Имеются данные о разрушении и деформации бластоцист при использовании данного метода [14].
Культуральная диагностика. Для культуральной диагностики используются среды Jones’ [35] или Boeck and Drbohlav’s [20], в отечественной научной литературе описана двухфазная питательная среда с коагулированным яичным белком и сывороткой крови животных, разработанная Беловой [1]. Отобранные образцы помещают на питательную среду и инкубируют в термостате в течение трех суток с последующей микроскопией. Показано, что субкультивирование бластоцист на специальных питательных средах позволяет увеличить чувствительность диагностики до уровня сопоставимого с ПЦР идентификацией [56, 65].
Молекулярно-генетические методы диагностики.
В настоящее время молекулярно-генетические методы детекции активно и используются в диагностике паразитарных инвазий, в частности бластоцистоза. Разработана методика идентификации возбудителя при помощи ПЦР диагностики с двумя парами праймеров к Barcode-участку SSUrDNA [51].
Использование субтип-специфических (STS) праймеров позволяет дифференцировать 7 основных субтипов Blastocystis sp.. Такой подход важен для эпидемиологических исследований, так как дает представление о распространении различных генотипов возбудителя среди популяций людей и животных. Отмечена высокая чувствительность и специфичность методов, основанных на применении полимеразной цепной реакции [54].
Изучение генетического полиморфизма возбудителя бластоцистной инвазии проводится также с испольщованием метода монолокусного секвенирования-типирования [54], анализа полиморфизма рестрикции ПЦР фрагментов (RFLP) [3].
Серологические исследования в настоящее время не используется для диагностики этой инфекции [ 74 ]. Иммунологические методы находятся в стадии разработки.
Многие лаборатории не регистрируют бластоцистную инвазию. Это связано с тем, что Blastocystis spp. имеют большое количество морфологических форм, что затрудняет диагностику при использовании метода микроскопии [13].
|